劉佳佳,邊云飛,肖傳實(shí),張娜娜,楊志明,楊慧宇

(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:yanghuiyu2010@126.com)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一類主要在巨噬細(xì)胞合成與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定及破裂關(guān)聯(lián)非常密切的蛋白水解酶類。斑塊局部巨噬細(xì)胞合成的MMPs通過(guò)降解纖維帽成分從而破壞其結(jié)構(gòu)促使斑塊破裂[1]。在巨噬細(xì)胞上有很多種LDL的受體以及相對(duì)應(yīng)的配體。LOX-1是近年來(lái)首先在牛血管內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的屬SR型的ox-LDL受體,屬于C型凝集素家族的Ⅱ型膜表面糖蛋白,這點(diǎn)不同于其他SR。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)膜上亦有與內(nèi)皮細(xì)胞基因序列完全相同的LOX-1表達(dá),并可識(shí)別和結(jié)合ox-LDL,在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成[2,3]。以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MMP-9在進(jìn)展期斑塊中的分布同氧化低密度脂蛋白受體LOX-1具有區(qū)域一致性,并且在表達(dá)量上兩者呈現(xiàn)相關(guān)性,表明LOX-1與MMP-9之間存在著重要關(guān)系[4],而LOX-1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的ox-LDL的受體,因此猜測(cè)ox-LDL是通過(guò)LOX-1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建LOX-1小干擾RNA(LOX-1-siRNA)抑制LOX-1基因表達(dá)后,觀察LOX-1對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞(細(xì)胞代號(hào)RAW264.7,ATCC,USA),LOX-1單克隆抗體(Santa Cruz,美國(guó));MMP-9單克隆抗體、ox-LDL購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;蛋白抽提試劑盒(Cell signaling,美國(guó)),RT-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst strand Cdna Synthesis Kit,Fermentas)、引物(大連寶生物有限公司)。

1.2 shRNA的設(shè)計(jì)及LOX-1-siRNA的構(gòu)建

根據(jù)GenBank提供的Lox-1基因序列(OLR1為NM-138648),通過(guò)Blast挑選2個(gè)長(zhǎng)為19個(gè)堿基的特異性寡核苷酸序列,序列1(LOX-1-siRNA1)為5′-GTCAGTGACCCTTATTGTA-3′,序列2(LOX-1-siRNA2)為5′-GTGGCCA GTTACTA CAAAT-3′。構(gòu)建LOX-1基因發(fā)卡樣siRNA(short hairpin small interference RNA,shRNA)真核表達(dá)載體(由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司完成)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM(GIBCO-BRL公司),5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱,穩(wěn)定傳代后以1×106/孔接種于6孔板,60%細(xì)胞匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將RAW264.7細(xì)胞分為4組,分別為空白對(duì)照組、LOX-1-siRNA1組、LOX-1-siRNA2組和質(zhì)粒對(duì)照組。采用LipofectamineTM2000(Invitrogen Corporation)轉(zhuǎn)染試劑,參照試劑說(shuō)明書(shū),每孔LOX-1-siRNA的轉(zhuǎn)染量為2 μg,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h使用Olympus熒光顯微鏡,先后在自然光和紫外激發(fā)光源經(jīng)GFP特異性濾色片濾光后觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況,選出最佳轉(zhuǎn)染組。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

隨機(jī)將RAW264.7細(xì)胞分成4組:對(duì)照組,即RAW264.7細(xì)胞正常培養(yǎng)組;ox-LDL組,即200 μg/ml ox-LDL與細(xì)胞共同孵育24 h;ox-LDL+LOX-1-siRNA組,即LOX-1-siRNA量為1.0 μg、Lipofectamine2000的量為2 μl轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞48 h,再加入200 μg/ml ox-LDL共同孵育24 h;pGenesil組,即空質(zhì)粒組。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)LOX-1及MMP-9 mRNA水平

LOX-1及MMP-9 mRNA的表達(dá)情況采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)檢測(cè),使用Trizol提取總RNA,并按照試劑盒說(shuō)明(TaKaRa)將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,按兩步法擴(kuò)增:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.6 Western blot檢測(cè)LOX-1及MMP-9蛋白表達(dá)水平

用細(xì)胞裂解液將巨噬細(xì)胞裂解,提取上清液即為總蛋白量,測(cè)定蛋白濃度。用聚丙烯酰胺凝膠電泳法將30 μl的總蛋白質(zhì)樣品分離,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)脫脂奶粉封閉2 h,加入羊抗鼠LOX-1及MMP-9單克隆抗體(1 ∶1 000)于4 ℃冰箱過(guò)夜,洗膜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000)共同孵育1 h,化學(xué)發(fā)光試劑顯色,分析蛋白條帶的吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 觀察細(xì)胞形態(tài)

使用含10%無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)基(高糖型)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)良好。傳代后多數(shù)細(xì)胞于2 h貼壁,主要為類圓形和不規(guī)則形,體積小,生長(zhǎng)快,一般含1-2個(gè)核,5-6 d可匯合,有偽足。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞LOX-1 mRNA的表達(dá)變化

與空白對(duì)照組和質(zhì)粒對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染LOX-1-siRNA1及LOX-1-siRNA2 48 h后兩組LOX-1 mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)(分別為0.673±0.087和0.482±0.110),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而且LOX-1-siRNA2的抑制作用更強(qiáng)一些(P<0.05),而空白對(duì)照組與質(zhì)粒對(duì)照組轉(zhuǎn)染后LOX-1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.00±0.01vs1.00±0.05,P>0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組LOX-1蛋白表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組和質(zhì)粒對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染LOX-1-siRNA1及LOX-1-siRNA2 48 h后細(xì)胞LOX-1蛋白表達(dá)明顯降低(0.576±0.105和0.432±0.074),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而且LOX-1-siRNA2的抑制作用更強(qiáng)一些(P<0.05),而空白對(duì)照組與質(zhì)粒對(duì)照組轉(zhuǎn)染后LOX-1的蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.83±0.089和0.84±0.144,P>0.05),與RT-PCR結(jié)果一致(見(jiàn)圖1)。

2.4 熒光顯微鏡觀察不同轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染結(jié)果

用不同比例的質(zhì)粒LOX-1-siRNA2與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑的復(fù)合物轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細(xì)胞后48 h,在熒光顯微鏡下可以觀察到轉(zhuǎn)染組綠色熒光細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%以上,而對(duì)照組無(wú)明顯熒光表達(dá)。當(dāng)LOX-1-siRNA2量為1.0 μg，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑為2 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，與其他任何組合相比，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1)。

LOX-1蛋白的表達(dá)量用LOX-1條帶的灰度值/內(nèi)參照actin的灰度值表示;與空白對(duì)照組和質(zhì)粒對(duì)照組比較,#P<0.05;與LOX-1-siRNA1相比,*P<0.05

表1 熒光顯微鏡觀察不同轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染效率Table 1 Transfection efficiency in different transfection conditions under fluorescence microscope

2.5 LOX-1-siRNA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果分析顯示:與對(duì)照組相比,ox-LDL(200 μg/ml)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞24 h后,MMP-9 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(0.788±0.024vs1.017±0.252,P<0.05)。pGenesil組(0.760±0.099)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ox-LDL+LOX-1-siRNA組與ox-LDL組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.938±0.098vs1.017±0.252,P<0.05)。

2.6 LOX-1-siRNA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明,ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞24 h后,MMP-9蛋白表達(dá)明顯增加,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(3.494±0.315vs0.986±0.057,P<0.05)。ox-LDL+LOX-1-siRNA組蛋白表達(dá)與ox-LDL組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.822±0.216vs3.494±0.315,P<0.05)。pGenesil組MMP-9蛋白與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖2)。

圖2 LOX-1-siRNA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of LOX-1-siRNA on ox-LDL-induced MMP-9 protein expression in macrophages

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重威脅著人類的健康,在動(dòng)脈粥樣病變?cè)缙?單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞攝入化學(xué)修飾低密度脂蛋白尤其是氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),形成巨噬源性泡沫細(xì)胞被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣病變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是細(xì)胞外基質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶,通過(guò)降解Ⅳ型膠原(血管基底膜的主要結(jié)構(gòu)成分)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂密切相關(guān)。研究表明,在人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊肩部及巨噬泡沫細(xì)胞聚集區(qū)MMP-9的表達(dá)增高,MMP9是MMP家族的成員,能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分和血管壁的基底膜。這會(huì)導(dǎo)致纖維帽破裂,影響斑塊穩(wěn)定性。MMP9的表達(dá)增加與許多疾病相關(guān),同時(shí)可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,并被認(rèn)為是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的主要因素[5,6]。研究證實(shí),培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞經(jīng)過(guò)ox-LDL的誘導(dǎo),MMP-9,MMP-3,MMP-1表達(dá)顯著增加,而巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生MMP-9的主要來(lái)源[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ox-LDL誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞24 h后,分別使用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶反應(yīng)(RT-PCR)和Western blotting的方法檢測(cè)各組MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

血管壁細(xì)胞上有多種受體可供ox-LDL結(jié)合,LOX-1是近年來(lái)首先在牛血管內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的ox-LDL受體。研究發(fā)現(xiàn),在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)ox-LDL促進(jìn)LOX-1及MMP-9的mRNA表達(dá)呈計(jì)量依賴性,當(dāng)用LOX-1特異性抗體PIA預(yù)刺激后,ox-LDL對(duì)MMP-9 mRNA的誘導(dǎo)作用明顯被抑制。本研究旨在探討LOX-1對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響,研究發(fā)現(xiàn),在ox-LDL誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞24 h后,可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞MMP9的表達(dá),通過(guò)構(gòu)建LOX-1小干擾RNA(LOX-1-siRNA)抑制LOX-1基因表達(dá)后,進(jìn)一步觀察到ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞MMP9蛋白及 mRNA的誘導(dǎo)作用明顯被抑制了,提示ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)這一過(guò)程中,LOX-1起到了關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。LOX-1對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響可能是動(dòng)脈粥樣硬化形成和不穩(wěn)定斑塊形成的機(jī)制之一,也可能是血管事件發(fā)生的原因之一。近年來(lái),巨噬細(xì)胞通過(guò)介導(dǎo)氧化應(yīng)激參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展已成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),ox-LDL與LOX-1的結(jié)合還可通過(guò)線粒體電子傳遞鏈、NADPH氧化酶等途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生,由此可以猜測(cè)LOX-1對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)的機(jī)制可能是通過(guò)線粒體電子傳遞鏈或NADPH氧化酶等途徑實(shí)現(xiàn)。