杜清春，王 鵬

（1. 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大理671000；2. 云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點實驗室，大理 671000）

布魯氏桿菌病（brucellosis），簡稱布病，是由革蘭陰性、兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的布魯氏桿菌（Brucella）引起的人獸共患疾病，是我國法定乙類傳染病，布魯氏桿菌由英國軍醫(yī)Bruce于1887年在因患馬耳他熱而致死的英國士兵脾臟中首次分離[1]。目前，F(xiàn)AO和WHO根據(jù)布魯氏桿菌的生化特性、對自然宿主的選擇性和致病性，將布魯氏桿菌屬分為6個種（species）19個生物型（biovars）。6個種分別為羊種（Brucella melitensis）、牛種（Brucella abortus）、豬種（Brucellasuis）、沙林鼠種（Brucella neotomae）、犬種（Brucella canis）和綿羊附睪種（Brucella ovis）；根據(jù)表型羊種分為3個生物型（1、2、3型），牛種分為8個生物型（1～7、9型），豬種分為5個生物型（1～5型），沙林鼠種、犬種和綿羊附睪種各一個生物型。另外還發(fā)現(xiàn)海洋哺乳動物有鯨型海洋種（Brucellaceti）和鰭型海洋種（Brucella pinnipedialis）2個新種，尚未正式命名和分類[1-2]。

1 布魯氏桿菌病的危害

布魯氏桿菌病的傳染源主要是病畜和感染者（包括野生動物），其中最危險和最常見的是被感染的母畜，其流產(chǎn)物及產(chǎn)后陰道分泌物中含有大量的布魯氏桿菌，若在處理時沒有采取必要的防護措施，則極易發(fā)生感染；此外，人通過食用含病原菌的病畜肌肉、內(nèi)臟和乳汁也可感染[3]。

在已知的6個布魯氏桿菌種中，對人具有感染性和侵襲力的是羊種、豬種、牛種和犬種，其中羊種布魯氏桿菌感染的數(shù)量最多，占90%以上[2-3]。母畜感染布魯氏桿菌的主要臨床癥狀是流產(chǎn)，其次是早產(chǎn)、死胎或弱胎[4]；有些母畜會發(fā)生子宮炎或膿腫導(dǎo)致生育能力下降、產(chǎn)乳量下降，有的還會發(fā)生關(guān)節(jié)炎和滑囊炎而導(dǎo)致跛行。公畜患病后主要表現(xiàn)為睪丸炎和副睪炎，后肢麻痹導(dǎo)致運動障礙[1-4]。

人感染布魯氏桿菌患病后主要表現(xiàn)為反復(fù)持續(xù)的發(fā)熱癥狀和關(guān)節(jié)腫脹疼痛，因關(guān)節(jié)炎而導(dǎo)致運動障礙。男性患者還會出現(xiàn)睪丸炎和前列腺炎，女性患者特別是妊娠期的孕婦會出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀[5]。目前，在全球170多個國家和地區(qū)已發(fā)現(xiàn)人、畜布魯氏桿菌病的存在和流行[2]。布魯氏桿菌病的爆發(fā)流行往往會給一個國家和地區(qū)的人民帶來生命和財產(chǎn)的巨大損失。特別是在牧區(qū)，如我國的新疆維吾爾族自治區(qū)、內(nèi)蒙自治區(qū)等地，有效地防治布魯氏菌病將直接關(guān)系到牧區(qū)人民的生活水平和我國的衛(wèi)生發(fā)展，而布魯氏桿菌病的檢測是布魯氏桿菌病防控中的重要環(huán)節(jié)，在布魯氏桿菌病的防控中有著重要的意義。

2 布魯氏桿菌檢測技術(shù)的研究現(xiàn)狀

2.1 病原學(xué)的檢測 檢測到布魯氏桿菌是診斷布魯氏桿菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”。布魯氏桿菌對營養(yǎng)的需求較高，一般用血清葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、肝湯瓊脂培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[6-7]，待菌落長出后，根據(jù)其形態(tài)特征、生長特性、生化反應(yīng)特點及染色特征進(jìn)行鑒別。布魯氏桿菌菌落生長形態(tài)呈稍隆起的圓形、邊緣整齊、光滑濕潤、大小為0.5～1.0 mm，在血瓊脂培養(yǎng)基上生長為白色，且不溶血，在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面上可長出水溶性微棕色菌苔。布魯氏桿菌的染色一般用柯茲羅夫斯基染色法染色，在顯微鏡下觀察，布魯氏桿菌為紅色球桿狀小桿菌，而其他菌為藍(lán)色，多呈散在分布，偶見成對、短鏈狀或串狀排列，邊緣稍圓或直[8]；布魯氏桿菌寬0.3～0.6 μm，長0.6～1.5 μm，無芽胞、無鞭毛、不形成莢膜。但是，由于布魯氏桿菌的培養(yǎng)時間較長（短則3～8 d，長則可達(dá)45 d），且布魯氏桿菌的分離率較低，常常影響臨床醫(yī)師對該病及時做出診斷，導(dǎo)致病情加重[7]；此外，布魯氏桿菌的分離培養(yǎng)對實驗人員和實驗環(huán)境有一定的要求，需要經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和有經(jīng)驗的專業(yè)技術(shù)人員在BSL-2（Biosafety Level 2 Laboratory）級以上的實驗室操作[8]。所以，布魯氏桿菌的分離培養(yǎng)一般不適合臨床的快速診斷和現(xiàn)場疫情的篩查，但可用于流行病學(xué)的追蹤調(diào)查。

2.2 血清學(xué)的檢測

2.2.1 虎紅平板凝集實驗（rose-bengal plate agglutination test，RBT） 用經(jīng)培養(yǎng)并滅活的布魯氏桿菌作為抗原，離心收集菌體經(jīng)虎紅染料染色后懸于乳酸緩沖液中制成。因該方法靈敏度高、檢測快速、操作簡便且價格合理，在國際貿(mào)易中被指定用于牛、羊、豬布魯氏桿菌病的檢測，適于動物群體布魯氏桿菌病的普查，也常用于人布魯氏桿菌病的初篩和監(jiān)測[7-8]。

2.2.2 試管凝集實驗（standard tube agglutination test，SAT） SAT于1897年開始應(yīng)用，是免疫學(xué)方法診斷布魯氏桿菌病的基石，雖然該方法在發(fā)達(dá)國家已停用，但目前仍然是我國診斷布魯氏桿菌病的法定方法[7-8]。SAT準(zhǔn)確性高、可以半定量、具有較高的特異性、對IgM敏感性高，用于布魯氏桿菌的早期診斷；但該方法操作繁瑣，需在37℃條件下孵育過夜，耗費時間長，且易出現(xiàn)假陽性和假陰性，不適用于現(xiàn)場疫情的快速篩查[8-9]。

2.2.3 全乳環(huán)狀實驗（protocol of milk ring test，MRT） MRT的本質(zhì)是抗原抗體的反應(yīng)，用經(jīng)染成紅色的布魯氏桿菌作為抗原，當(dāng)奶樣中存在布魯氏桿菌抗體時，紅色的抗原抗體復(fù)合物便會轉(zhuǎn)移至乳脂層，從而形成紫紅色的乳脂環(huán)[7]。MRT主要用于乳樣中的布魯氏桿菌篩查，且世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定該方法只能用于奶牛檢測。因MRT操作簡便快速、檢測成本低廉，常用于現(xiàn)場大規(guī)模奶牛篩查檢測，但該方法敏感性差，在檢測牛初乳、發(fā)情旺盛期奶牛、接近干奶期的奶牛、患乳房炎的奶牛等均可能會出現(xiàn)假陽性[7-9]。

2.2.4 補體結(jié)合實驗（complement fixation test，CFT） 主要根據(jù)是否發(fā)生溶血現(xiàn)象來判斷受檢血清中有無抗體[10]。CFT是世界動物衛(wèi)生組織公認(rèn)的布魯氏桿菌病確診性實驗，相對于其他血清學(xué)檢測方法，CFT的特異性強和敏感度高，適用于牛、羊、綿羊附睪種布魯氏桿菌病的診斷[8-9]。由于豚鼠補體的作用效果會受到豬的補體干擾，使實驗敏感性下降38%～40%，因此CFT不適用于豬布魯氏桿菌病的檢測和診斷[7-11]；此外，CFT主要通過肉眼觀察溶液顏色的變化來判斷溶血程度，結(jié)果帶有一定的主觀性，且該方法實驗操作步驟繁瑣，對實驗人員要求較高，不適宜在基層推廣和現(xiàn)場檢測[12]。

2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ Enzyme-linked immuonsorbant assay，ELISA） ELISA相對于其他血清學(xué)檢測方法而言，其靈敏度高、特異性強，所需樣品量少，可以用作確診實驗，同時也可用于大批量樣本篩查[13]，在布魯氏桿菌病診斷中，主要用于血清和乳樣中抗體的檢測。1976年，Carin-Bastuji等[14]第一次用ELISA檢測血清中布魯氏桿菌抗體，并發(fā)現(xiàn)該方法的靈敏度是SAT的10～100倍。目前，ELISA所選用的抗原主要是S-LPS，抗原決定族又主要位于LPS的O鏈上，但粗糙型布魯氏桿菌的表面缺乏O鏈，所以基于LPS-O鏈的檢測方法無法確診粗糙型布魯氏桿菌感染引發(fā)的布病[13]。雖然ELISA靈敏度高，卻不能分辨出接種牛種布魯氏桿菌或羊種Rev1疫苗產(chǎn)生的抗體和自然感染產(chǎn)生的抗體，故多用于非免疫家畜的篩查；ELISA具有高特異性和高敏感性等優(yōu)點，于2004年被世界動物衛(wèi)生組織列為診斷牛種布魯氏菌病的推薦方法[13-14]。ELISA操作繁瑣，需在BSL-2級實驗室內(nèi)進(jìn)行，不適用于現(xiàn)場快速檢測及向基層推廣[15]。

2.2.6 膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatography，GICA） GICA操作簡單，檢測時間短（2 min后觀察結(jié)果，15 min完成檢測），對實驗人員要求不高，血清樣品用量少，且方法特異、靈敏，適用于臨床疾病的初步診斷、現(xiàn)場疫情的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查研究，也用于人布魯氏桿菌病的監(jiān)測[16]。當(dāng)用GICA檢測組織切片中菌體抗原時，最小檢出量為200 CFU/mL，其敏感性略高于ELISA和PCR[17-18]。但是，GICA只能做定性篩查還不能實現(xiàn)定量、質(zhì)控指標(biāo)統(tǒng)一以及其靈敏度還需進(jìn)一步提高[19]。目前，膠體金試紙條市場需求較大，特別是在各醫(yī)院檢驗科，因該方法成本低且簡便快速，常常作為初篩的手段。

2.3 核酸檢測技術(shù)

2.3.1 普通PCR（polymerase chain reaction） 目前，普通PCR法檢測布魯氏菌病的引物主要有編碼BCSP-31序列的B4/B5、16SrRNA（F4/R2）、外膜蛋白如omp31、 omp10、omp2a、omp2b等[20]。1990年，F(xiàn)eteke等首次應(yīng)用PCR技術(shù)檢測布魯氏桿菌病，表明該方法特異性強，靈敏度高，操作簡便，檢測時間相對較短，可用于大批量樣品的檢測[3-5,20]。單對引物的PCR雖然可檢出含有布魯氏桿菌的樣品，但不能完全區(qū)分鑒別布魯氏桿菌屬的所有生物型。

2.3.2 多重PCR 即在同一反應(yīng)體系中加入兩對及以上的引物，能同時檢出多種病原的PCR技術(shù)。Bricker等[21]于1994年首次報道了能區(qū)分牛種、羊種、綿羊附睪種和豬種布魯氏桿菌的AMOS-PCR法，該方法能檢測到四種布魯氏桿菌的部分生物型，如牛種的1、2、4型，羊種的3個型，豬種的1型等。1999年，Sreevatsan等[22]根據(jù)BCSP31K基因和hsp65基因設(shè)計引物，建立了能檢測牛奶及牛鼻分泌物中的牛分支桿菌和布魯氏桿菌的二重PCR。多重PCR具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟簡便等優(yōu)點，能在同一反應(yīng)管內(nèi)檢測多種病原體，節(jié)約了時間和試劑，為臨床診斷提供更多的依據(jù)[22]。鐘旗等[23]應(yīng)用AMOS-PCR法進(jìn)一步鑒定布魯氏桿菌生物型后，發(fā)現(xiàn)該方法還可以鑒定犬種布魯氏桿菌，能區(qū)分S19疫苗株和野毒株，表明AMOS-PCR法的特異性和敏感性均高于布魯氏桿菌的分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法。此外，彭小兵等[24]于2010年以eri作為布魯氏桿菌屬的特異性基因，同時以IS711基因的拷貝數(shù)差異為布魯氏桿菌種間特異性標(biāo)志，建立了能同時鑒別羊種、牛種和豬種的三重PCR。雖然多重PCR能同時檢測多種病原體，但其引物設(shè)計復(fù)雜，而且易產(chǎn)生PCR的副產(chǎn)物焦磷酸[22-23]。

2.3.3 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence qPCR） Redkar等[25]于2000年根據(jù)IS711元件設(shè)計了上游引物，根據(jù)每個菌種的特異序列設(shè)計下游引物，并用熒光標(biāo)記，由此建立了能特異性檢測牛種布魯氏桿菌、羊種布魯氏桿菌和豬流產(chǎn)布魯氏桿菌的實時熒光定量PCR。2005年，Debeaumont等[26]建立了能夠檢測人血清中布魯氏桿菌的RT-PCR，結(jié)果表明其特異性和敏感性均強于病原的分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法。實時熒光定量PCR具有高度特異性和敏感性，是目前確定樣品中DNA拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法，它最大的優(yōu)點在于克服了終點PCR在進(jìn)入平臺期后進(jìn)行定量帶來的誤差，實現(xiàn)了DNA或RNA模板的精確定量；此外，實時熒光定量PCR比普通PCR操作簡便，不用進(jìn)行電泳，避免了因擴增產(chǎn)物帶來的污染，同時大大縮短了檢測時間，在3 h之內(nèi)即可得出結(jié)果[25-26]。由于實時熒光定量PCR需要特殊的檢測設(shè)備，所用試劑如探針、Mix等比較昂貴，為了避免污染需對實驗室進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)，對實驗人員要求較高，所以不適于在基層推廣和現(xiàn)場檢測[22,27]。

3 展望

目前，世界范圍內(nèi)檢測布魯氏桿菌的方法主要有病原體的分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法和PCR技術(shù)，血清學(xué)診斷仍是我國的法定方法。但無論何種方法，都存在某些不足之處，也不能相互取代，到目前為止，還未有單一的方法適用于任何情況下進(jìn)行快速準(zhǔn)確的布病檢測。所以，建立一種特異性強、靈敏度高、簡便快速、可以同時檢測多種病原體并能適用于流行病學(xué)調(diào)查和大批量樣品篩查的檢測方法，不僅是時代的需求，也是現(xiàn)代公共衛(wèi)生需要重點突破的難題。實時熒光定量PCR技術(shù)因其特異性強、靈敏度高并能對DNA含量進(jìn)行實時定量，逐漸被廣泛應(yīng)用。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，手?jǐn)y式熒光檢測PCR儀的面市，現(xiàn)場檢測已可逐步實現(xiàn)，建立起多重實時熒光定量PCR檢測方法，不僅能在同一反應(yīng)體系中同時檢測多種病原體，還能節(jié)約時間、試劑和費用，大大提高了檢測效率。