首姣琴，程曉蕾，王霄旸，薛飛群，王 米，劉迎春，費陳忠，張麗芳，張可煜，李 娟

（1.湘潭大學(xué)化學(xué)學(xué)院，湘潭411100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用化學(xué)藥物及制劑學(xué)重點實驗室，上海 200241）

硝唑尼特（NTZ）是一種硝基噻唑酰胺化合物，其化學(xué)名為2-乙酰氧基-（5-硝基-2-噻唑）苯甲酰胺。1984年首次報道用于抗人體無鉤絳蟲和微小膜殼絳蟲[1]。2002年11月被美國FDA批準(zhǔn)為第一個專門用來治療隱孢子蟲感染的藥物，并以商品名為Alinia投放市場[2]。硝唑尼特是一種前藥，該藥進(jìn)入血漿后迅速被代謝成具有活性的替唑尼特（TIZ）[3]。多年來，研究發(fā)現(xiàn)硝唑尼特和/或替唑尼特能有效防治許多腸道寄生蟲，如鞭毛蟲[4]、內(nèi)阿米巴[5]、利什曼原蟲[6]，且對多種細(xì)菌和病毒感染也有效，如幽門螺旋桿菌、難辨梭狀芽胞桿菌[7]、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等；甚至還發(fā)現(xiàn)硝唑尼特對某些腫瘤細(xì)胞的抑制作用[8]。由此可見，硝唑尼特/替唑尼特生物學(xué)功能眾多。

細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）是一類包含有氧自由基和H2O2的總稱，是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸和代謝的副產(chǎn)物，其產(chǎn)生的主要場所是線粒體[9]。巨噬細(xì)胞以模式識別方式結(jié)合、捕獲、吞噬和殺傷細(xì)菌等病原體后，巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS迅速增加，以產(chǎn)生強氧化性物質(zhì)參與殺傷病原體[10-11]。細(xì)胞中的抗氧化物質(zhì)和酶系統(tǒng)也維持正常的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，使其保持正常的功能。如果機(jī)體ROS產(chǎn)生和抗氧化失去平衡，就會引起各種退行性的疾病，如衰老、化學(xué)損傷、動脈粥樣硬化、癌癥、糖尿病以及各種炎癥性疾病[12]。硝唑尼特/替唑尼特對多種病原體具有很好的療效，但對細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響研究尚未見報道。鑒于此，本研究用LPS刺激大鼠單核巨噬細(xì)胞系（RAW264.7細(xì)胞），觀察替唑尼特對LPS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎性因子分泌的影響，旨在進(jìn)一步發(fā)掘替唑尼特可能的抗氧化、抗炎作用，為其應(yīng)用于感染性疾病的治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物與細(xì)胞系 替唑尼特，由上海獸醫(yī)研究所獸用抗感染藥物創(chuàng)新團(tuán)隊合成，含量＞98%。替唑尼特（100 mmol/L）用二甲基亞砜（DMSO）溶解并使用有機(jī)相濾器（0.22 μm）過濾除菌，-20℃分裝避光保存，臨用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋至工作濃度；LPS溶解于PBS溶液中配制成儲備液（1 mg/mL），臨用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋至工作濃度（1 μg/mL）。小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑 二甲基亞砜（DMSO）購于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)、胎牛血清購于Gibco公司；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總谷胱甘肽（T-GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）測定試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所；ROS、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和RIPA裂解液均購自碧云天生物技術(shù)研究所；IL-6 ELISA檢測試劑盒，購自R & D公司；COX-2 和β-actin抗體購于CST公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠（兔）IgG購于Abcam公司。其他試劑全部為分析純。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活性 將生長良好的細(xì)胞以1×105個/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加入脂多糖和不同濃度的替唑尼特，每組設(shè)5個重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基并向每孔中加入150 μL DMSO，置于搖床上震蕩混勻，使結(jié)晶完全溶解，讀取OD570，計算細(xì)胞活性。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測 細(xì)胞以3×105個/mL的密度均勻接種于放置有蓋玻片的6孔板中，細(xì)胞貼壁12 h后隨機(jī)分為溶劑對照組（V組，含0.1 %的DMSO）、脂多糖模型組（LPS組，含LPS 1 μg/mL）和替唑尼特處理組（含1 μg/mL LPS和25、50、75、100 μmol/L替唑尼特）培養(yǎng)6 h。按照1∶1000的比例用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA，每孔不少于1 mL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA后將蓋玻片置于熒光顯微鏡下觀察，任選三個視野拍照，并用Image J圖像分析軟件包分析平均熒光強度。

1.5 細(xì)胞內(nèi)MDA檢測 利用MDA與硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的原理，檢測細(xì)胞中MDA的含量。細(xì)胞經(jīng)1.4項相同處理培養(yǎng)24 h后，以1×107個細(xì)胞加入100 μL RIPA裂解液的比例冰上裂解細(xì)胞10 min，隨后4℃、12 000×g離心10 min，收集細(xì)胞上清液，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。嚴(yán)格按照MDA檢測試劑盒的說明書步驟檢測細(xì)胞裂解液中MDA的含量，用紫外分光光度計在532 nm檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度計算各樣品中MDA含量并用各樣品的蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.6 GSH含量的檢測 按照1.5項所述方法收集細(xì)胞裂解液，收集樣本后必須盡快用試劑四處理防止谷胱甘肽代謝，經(jīng)試劑四處理后的樣本置于-20℃保存。利用DTNB的循環(huán)反應(yīng)，按照試劑盒說明書在酶標(biāo)儀（405 nm）讀取吸光度值計算出還原型谷胱甘肽的含量。還原型谷胱甘肽（GSH）含量=T-GSH含量-2×GSSG含量。

1.7 抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的檢測 按照1.5項所述方法收集細(xì)胞裂解液，用BCA法定量蛋白，盡量當(dāng)天檢測，如需過夜于-80℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書黃嘌呤氧化酶還原法（450 nm）檢測SOD活性，鉬酸銨終止法（520 nm）檢測CAT活性，二硫代二硝基苯甲酸法（412 nm）檢測GSH-Px活性。

1.8 ELISA檢測IL-6 細(xì)胞平鋪在24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中（2×105個/孔），待細(xì)胞生長至匯集度約80%，加入LPS和替唑尼特并孵育24 h。將細(xì)胞培養(yǎng)液10 000×g離心5 min并收集上清。參照ELISA試劑盒操作手冊，進(jìn)行細(xì)胞因子的含量測定，讀取波長為450 nm的吸光度值并計算測定培養(yǎng)液中IL-6的含量。

1.9 細(xì)胞內(nèi)COX-2蛋白表達(dá)檢測 按照1.5項所述方法收集細(xì)胞上清，向所收集的液體中按1∶4加入5×上樣緩沖液，100℃變性5 min，瞬時離心后樣本于-80℃保存待用。取等量總蛋白于10% SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，然后室溫條件下?lián)u床上封閉2 h。COX-2多克隆抗體4 ℃下孵育過夜后，TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min，二抗孵育1 h，TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。ECL顯色系統(tǒng)顯色。軟件Image J分析條帶及其灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)以±S表示，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 LPS和替唑尼特對細(xì)胞活性的影響 為了建立有效的實驗?zāi)Ｐ停治鯨PS和替唑尼特作用下的RAW264.7細(xì)胞其活性，以排除藥物的細(xì)胞毒性對模型的干擾。結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞活性隨著替唑尼特藥物濃度的升高而呈現(xiàn)降低趨勢。經(jīng)50 μmol/L至150 μmol/L的替唑尼特作用后，細(xì)胞存活率保持在100%左右，與對照組無顯著差異。而200 μmol/L及以上濃度的細(xì)胞活性卻出現(xiàn)下降，并與溶劑對照組成顯著差異，250 μmol/L濃度下細(xì)胞的存活率甚至只有77%±5%。因此，以下研究采用150 μmol/L以下替唑尼特藥物濃度進(jìn)行。

2.2 替唑尼特抑制細(xì)胞ROS生成 LPS刺激巨噬細(xì)胞和替唑尼特處理RAW264.7細(xì)胞6 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS引起的熒光亮度及與空白對照組的比值結(jié)果見圖2。從圖2可知，RAW264.7細(xì)胞在未受刺激時空白對照組（V組）會產(chǎn)生一定量的ROS，而LPS刺激6 h后, 胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P＜0.01），約升高8.0倍。而替唑尼特處理后則可以呈劑量依賴性地抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ROS（P＜0.01），50 μmol/L和75 μmol/L作用后分別比LPS刺激組降低了1.3倍和4.5倍。

2.3 替唑尼特減少MDA含量、提高還原型GSH含量 由圖3可知，LPS刺激組較對照組的MDA含量顯著升高（P＜0.01），還原型GSH含量顯著降低（P＜0.01），提示LPS可引起RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力下降。與LPS模型組相比，替唑尼特在較低濃度25 μmol/L時MDA含量和還原型GSH含量均無顯著性變化（P＞0.05）。相對于LPS組，替唑尼特在75 μmol/L和100 μmol/L時MDA含量分別降低了0.2倍和0.3倍，還原型GSH含量都升高約0.4倍，差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。說明替唑尼特可以通過降低氧化產(chǎn)物含量和提高還原型物質(zhì)的含量緩解LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

圖1 替唑尼特和LPS共同作用對RAW264.7細(xì)胞活性的影響Fig. 1 Effects of tizoxanide and LPS on RAW264.7 cells

2.4 替唑尼特拮抗LPS抑制SOD、CAT、GSH-Px酶活性 如圖4所示，LPS刺激組SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著低于空白組（P＜0.01），經(jīng)25 μmol/L替唑尼特處理后這三種酶活性均升高，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L及以上濃度的替唑尼特處理后，細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px酶活性較LPS模型組均以濃度依賴的方式顯著升高（P＜0.01）。說明替唑尼特可以提高RAW264.7細(xì)胞中多種抗氧化酶的活性，提高細(xì)胞的抗氧化能力。

2.5 替唑尼特抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6分泌 替唑尼特對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6量的影響見圖5。如圖5所示，LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞的IL-6分泌量顯著性地升高，而替唑尼特處理后，各劑量組均能顯著降低IL-6的分泌量。然而經(jīng)過檢測也發(fā)現(xiàn)替唑尼特處理后對IL-8的分泌無顯著影響。

圖2 替唑尼特抑制LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROSFig. 2 Tizoxanide inhibits LPS induced cells to produce ROS

2.6 替唑尼特抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá) 替唑尼特對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞COX-2的表達(dá)量的影響見圖6。如圖6所示，LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞的COX-2表達(dá)量顯著升高，而替唑尼特處理4 h后，COX-2蛋白表達(dá)量顯著降低，且呈劑量相關(guān)性。

圖3 替唑尼特對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)的MDA和GSH產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of TIZ on LPS induced MDA and GSH production in RAW264.7 cells

3 討論

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞膜外膜的主要組成成份，LPS可以誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和炎性反應(yīng)因子的釋放[13]。巨噬細(xì)胞是參與機(jī)體固有免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)富含溶酶體酶，具有很強的吞噬、殺菌和清除各種引起機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的受損組織和細(xì)胞的能力[14]。所以，保障巨噬細(xì)胞功能的正常是機(jī)體炎癥反應(yīng)得以消除的關(guān)鍵。研究表明，在感染的情況下，巨噬細(xì)胞通過ROS和釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致組織損傷[12]。本研究證實了替唑尼特能顯著減少重要的細(xì)胞炎癥因子IL-6的釋放，同時進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)替唑尼特能顯著性地降低COX-2的表達(dá)量。IL-6參與炎癥反應(yīng)和發(fā)熱反應(yīng)，而COX-2是前列腺素合成所必須的酶，其功能是合成前列腺素，產(chǎn)生的前列腺素是疼痛和炎癥反應(yīng)的主要因素[15]。因此，篩選能抑制炎癥狀態(tài)下IL-6的釋放和COX-2被激活的藥物是有效的抗炎藥物篩選的重要途徑之一。替唑尼特能有效抑制IL-6的釋放和COX-2被LPS所激活，說明替唑尼特具有應(yīng)用于與炎癥及相關(guān)治療的潛力。

圖4 替唑尼特對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)的SOD(A)、CAT(B)和 GSH-Px(C)的影響Fig. 4 Effects of TIZ on LPS induced SOD(A), CAT(B)and GSH-Px(C) production in RAW264.7 cells

圖5 替唑尼特對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6量的影響Fig. 5 Effects of TIZ on LPS induced IL-6 in RAW264.7 cells

圖6 替唑尼特對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞COX-2的表達(dá)量的影響Fig. 6 Effects of TIZ on LPS induced COX-2 expression in RAW264.7 cells

機(jī)體在正常代謝過程中產(chǎn)生的少量的自由基，可被自身抗氧化系統(tǒng)中的抗氧化物（如SOD、CAT和GSH等）及時清除以維持體內(nèi)的代謝平衡。當(dāng)活性氧不能被及時清除或抑制時，能夠使細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA進(jìn)而損傷細(xì)胞。MDA的量可間接反映機(jī)體抗氧化酶的功能[16]。SOD是抗氧化酶防御系統(tǒng)的重要成員，可專一性催化超氧陰離子生成H2O2和O2。H2O2可進(jìn)一步被CAT和GSH-Px催化分解成H2O，從而阻止超氧陰離子轉(zhuǎn)化為活性更高的-OH。SOD、CAT和GSH-Px間接反應(yīng)了機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化能力，且三者之間相互協(xié)調(diào)，共同維護(hù)著自由基的代謝平衡[17-18]。本研究用LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的細(xì)胞氧化損傷作用，在LPS刺激下ROS、MDA都顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px都顯著降低，證明氧化應(yīng)激模型是成功的。給予替唑尼特處理的細(xì)胞可以顯著性地抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成和MDA含量升高，表明替唑尼特可以通過有效壓制LPS誘導(dǎo)的氧化效應(yīng)從而拮抗LPS引起巨噬細(xì)胞損傷。

綜上所述，替唑尼特能通過抑制炎性細(xì)胞因子的釋放、抑制各種氧化因子的產(chǎn)生以及增強細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的能力而拮抗LPS誘導(dǎo)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞氧化損傷和炎性細(xì)胞因子分泌，保護(hù)細(xì)胞、抵抗炎癥的發(fā)展。這為進(jìn)一步挖掘替唑尼特的抗炎作用及其闡明其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。