趙文影，姜一峰，虞凌雪，趙 款，朱豪杰，高 飛，李國(guó)新，張玉嬌，李麗薇，周艷君，劉雪蘭，童光志,3

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥230036；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是目前已知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，是將抗原遞呈給B細(xì)胞和T細(xì)胞從而引發(fā)獲得性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞[1]。DC于19世紀(jì)30年代被美國(guó)學(xué)者分離出來(lái)，在抗病毒、腫瘤治療的研究中均得到廣泛應(yīng)用[2-3]。目前公認(rèn)的DC類型按來(lái)源主要有兩種：髓系和淋巴系，二者在特性和功能上存在一定差別，但是均具有很強(qiáng)的抗原遞呈能力，在獲得性免疫應(yīng)答建立過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。獲取人源和鼠源DC的方法較為成熟，有商品化的試劑盒可供使用，但目前還沒(méi)有商品化的豬源DC分化試劑盒可供使用，各種豬源DC分化方法間也存在較大差別。本研究對(duì)豬外周血和骨髓源單核細(xì)胞DC分化方法進(jìn)行比較和研究，建立了成熟的外周血和骨髓單核細(xì)胞源DC分化方法，為進(jìn)一步研究病毒感染后豬體建立獲得性免疫應(yīng)答的機(jī)制奠定了平臺(tái)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液（50494LSM?Lymphocyte Separation Medium）購(gòu)自Biomedicals MP公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自Biosharp公司，Recombinant Porcine IL-4和Recombinant Porcine GM-CSF購(gòu)自R&D公司，CD152（CTLA-4）-muIgR-APC Conjugate 購(gòu)自ANCELL公司，胎牛血清（FBS）和RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，流式細(xì)胞分析儀型號(hào)為艾森NovoCyte 452170627408。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 15日齡豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、偽狂犬病毒（Psevdorabies virus，PRV）和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus，PCV2）陰性健康試驗(yàn)豬只購(gòu)自上海某豬場(chǎng)。

1.3 外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）制備 靜脈采集15日齡豬只抗凝血按照50494 LSM?Lymphocyte Separation Medium說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PBMC的分離。取9 mL抗凝血用PBS進(jìn)行2倍稀釋；將稀釋后的抗凝血緩慢加入同體積的淋巴細(xì)胞分離液中，采用500×g的轉(zhuǎn)速在室溫下離心30 min（快速升速，緩慢降速）；用長(zhǎng)槍頭緩慢吸出液體中間層的PBMC；將吸出的PBMC用400×g的轉(zhuǎn)速在4℃下離心5 min；若底部有紅細(xì)胞，則按1∶4體積加入紅細(xì)胞裂解液，靜置10 min后在4℃溫度下以400×g的轉(zhuǎn)速離心5 min，之后用PBS洗滌3次；最后用含1%雙抗的無(wú)血清RPMI-1640重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)并鋪板。

1.4 骨髓源單核細(xì)胞的分離 取15日齡的仔豬股骨和脛骨，盡可能的去除附著的肌肉和結(jié)締組織并在75%的酒精中浸泡5 min；用酒精燈輕微煅燒，而后用PBS沖洗干凈；用滅菌的骨鉗剪開(kāi)股骨和脛骨兩端的骨膜，然后用滅菌的骨髓穿刺針在其兩端穿孔；用含有1%雙抗的不完全RPMI-1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液；用500×g的轉(zhuǎn)速離心10 min, 棄掉上清；用紅細(xì)胞裂解液裂解5 min后，在4℃下用500×g的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清；用PBS洗滌2次，用含1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再用70 nm的無(wú)菌細(xì)胞篩過(guò)濾并計(jì)數(shù)。

1.5 外周血源單核細(xì)胞的分化 將1.3中制備的PBMC按每孔2×106個(gè)細(xì)胞數(shù)量鋪于六孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h，棄去上清，用無(wú)血清RPMI-1640清洗滌洗2次，此時(shí)貼壁的細(xì)胞為較為純凈的豬PBMC。用終濃度為100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素和0.25 mg/mL兩性霉素B的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，用不同濃度的GM-CSF和IL-4進(jìn)行刺激分化，持續(xù)7 d。每隔2.5 d，替換一半包含相同濃度細(xì)胞因子的完全RPMI-1640培養(yǎng)基，刺激后第7 d在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)DC細(xì)胞表面分子標(biāo)志。

1.6 骨髓源單核細(xì)胞的分化 將1.4中制備的骨髓細(xì)胞按1.5中的方法進(jìn)行DC細(xì)胞表面分子標(biāo)志檢測(cè)。

1.7 DC表面分子標(biāo)志檢測(cè) 將5×105個(gè)DC取置于1.5 mL EP管內(nèi)進(jìn)行流式染色，取5 μL CD152抗體加入管內(nèi)，混勻后置于4℃ 避光靜置30 min；PBS洗滌3次；用含1% FBS的杜氏磷酸緩沖液（Dulbecco's phophate buffered saline，DPBS）重懸細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 外周血來(lái)源和骨髓源單核細(xì)胞源DC形態(tài) 通過(guò)單核細(xì)胞貼壁時(shí)間以及刺激濃度的選擇，確定當(dāng)單核細(xì)胞貼壁12 h后，能夠獲得最多的分化的DC（結(jié)果未展示）。刺激7 d后外周血單核細(xì)胞和骨髓源單核細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞直徑變大且表面出現(xiàn)突觸（圖1）。

圖1 單核細(xì)胞形態(tài)變化Fig.1 Morphology change during stimulation

2.2 外周血單核細(xì)胞源DC分化條件的確定 采取不同濃度的GM-CSF和IL-4對(duì)貼壁12 h的單核細(xì)胞持續(xù)刺激，對(duì)刺激后0 d、5 d和7 d后的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)GM-CSF濃度為80 ng/mL、IL-4濃度為40 ng/mL時(shí)，刺激后7 d能夠獲得最大比例的樹(shù)突狀細(xì)胞（圖2）。

2.3 外周血單核細(xì)胞源DC刺激分化結(jié)果 選取15日齡仔豬外周血分離PBMC，貼壁12 h后用終濃度為80 ng/mL的GM-CSF和40 ng/mL的IL-4對(duì)PBMC持續(xù)刺激7 d，用抗CD152抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示通過(guò)此方法能夠?qū)?1.66%的PBMC細(xì)胞刺激分化為CD152+的樹(shù)突狀細(xì)胞（圖3）。

圖2 不同刺激條件下CD152+細(xì)胞比率Fig.2 The ratio of CD152+ cells stimulated with different conditions

圖3 外周血單核細(xì)胞源DC表面分子CD152的活化情況Fig.3 Detection of CD152+ cells from PBMCs

2.4 骨髓源DC刺激分化結(jié)果 參考外周血分化DC的方法，利用80 ng/mL的GM-CSF和40 ng/mL的IL-4對(duì)骨髓源單核細(xì)胞進(jìn)行刺激，連續(xù)刺激7 d后，用CD152抗體檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示用此方法能夠顯著刺激骨髓源DC的分化，可以獲得約63%的CD152+細(xì)胞（圖4）。

3 討論

樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）是免疫系統(tǒng)中最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞和誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞分化的細(xì)胞，是連接先天性和獲得性免疫的關(guān)鍵[5]。DC表達(dá)一系列的模式識(shí)別受體，通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別入侵宿主的微生物、病毒及內(nèi)源性危險(xiǎn)的信號(hào)分子，從而觸發(fā)多種免疫反應(yīng)，在抗病毒、抗腫瘤免疫以及免疫耐受的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6-8]。

圖4 骨髓單核細(xì)胞源DC表面分子CD152的活化情況Fig. 4 Detection of CD152+ cells from the bone-derived DC

DC是由造血干細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子刺激下分化而來(lái)，并觸發(fā)不同類型的效應(yīng)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化[9-10]。DC的分化成熟是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程不僅與DC亞群的特性有關(guān)，還與其所在的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。傳統(tǒng)的DC細(xì)胞主要分為3個(gè)亞群：pDC、cDC1和cDC2[11]。另外，造血干細(xì)胞也可分化為單核細(xì)胞源的DC細(xì)胞（MoDC），且由于單核細(xì)胞具有較多與髓樣cDC2共有的表面標(biāo)記分子，MoDC很難與髓樣cDC2區(qū)分[12-14]。在體外培養(yǎng)MoDC的過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)IL-4和GM-CSF是誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC分化的主要細(xì)胞因子[15]。IL-4是抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，從而引導(dǎo)單核細(xì)胞向DC方向分化，GM-CSF是促進(jìn)DC存活及分化的最有效的細(xì)胞因子[16-20]。DCs形態(tài)不規(guī)則，表面許多膜狀或樹(shù)突狀突起，細(xì)胞表面有特征性標(biāo)志分子，如CD80、CD86，CD152，CD83[21-22]。目前豬源的DC特征性標(biāo)記分子還不明確，人們現(xiàn)在最常用的標(biāo)記分子是CD86、CD80、CD152、CD83等[22-23]。在本研究前期實(shí)驗(yàn)中，我們選取了一些人源和鼠源的CD86、CD83和CD152抗體，在分化成熟后進(jìn)行流式檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有人源的CD152抗體能檢測(cè)到DC的分化情況，這與其他一些實(shí)驗(yàn)者的數(shù)據(jù)不一致[24-25]，我們推測(cè)可能是由于豬的品種以及選擇的流式抗體來(lái)源不同造成的。在本實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)外周血來(lái)源和骨髓來(lái)源單核細(xì)胞分化DC的條件進(jìn)行了摸索探究，以期找到能更好的分化DC的方法。在實(shí)驗(yàn)初期，采用外周血來(lái)源的單核細(xì)胞對(duì)刺激濃度及刺激時(shí)間進(jìn)行摸索同時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變大，表面有樹(shù)突狀突起，且在前期成團(tuán)，后期呈單一分布并半懸浮于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。對(duì)豬只日齡和刺激濃度的比較發(fā)現(xiàn)，15日齡豬只的PBMC在經(jīng)過(guò)7 d連續(xù)刺激且刺激物GM-CSF的濃度為80 ng/mL和IL-4的濃度為40 ng/mL時(shí)獲得較大比例的DC，這與Park[23]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，我們推測(cè)可能與豬的品種有關(guān)。隨后我們參照外周血來(lái)源單核細(xì)胞分化DC的方法，建立了骨髓源單核細(xì)胞分化DC方法。對(duì)這兩種方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)骨髓源單核細(xì)胞分化DC的方法獲得的DC較為純凈（未展示），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到63%以上且更適合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，而外周血來(lái)源單核細(xì)胞分化DC的方法不確定因素太多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性稍差。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兩種DC分化方法的摸索與比較，建立了外周血來(lái)源DC和骨髓源DC分化方法，為進(jìn)一步研究病毒感染后豬體建立獲得性免疫應(yīng)答的機(jī)制奠定了平臺(tái)基礎(chǔ)。