黃婉蘭

[摘要]目的 探討紫杉醇（TAX）對(duì)人鼻咽癌低分化鱗癌HNE1細(xì)胞系增殖和凋亡的影響。方法 采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同濃度TAX對(duì)HNE1細(xì)胞的增殖抑制情況，TAX 0、2.5、5、10、20、40、80 nmol/L對(duì)HNE1細(xì)胞分別作用12、24、36、48、72 h，以TAX 0 nmol/L作為對(duì)照組，采用流式細(xì)胞術(shù)和原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)不同濃度TAX對(duì)HNE1細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 72 h最高增殖抑制率超過(guò)70%，不同濃度TAX（2.5、5、10、20、40、80 nmol/L）對(duì)HNE1細(xì)胞的增殖抑制率與作用時(shí)間呈時(shí)效關(guān)系（P<0.05），但與藥物濃度未呈量效關(guān)系（P>0.05）;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況顯示，TAX 0、5、10、20 nmol/L作用HNE1細(xì)胞48 h的早期及中晚期凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），呈濃度依賴關(guān)系。TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況顯示，TAX 0、5、10、20 nmol/L作用HNE1細(xì)胞48 h后的凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 TAX能夠抑制人鼻咽癌低分化鱗癌HNE1細(xì)胞系的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]紫杉醇;HNE1細(xì)胞;增殖;凋亡

[中圖分類號(hào)] R739.63 ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）11（b）-0085-03

Effect of Paclitaxel on proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma with poorly differentiated squamous cell carcinoma HNE1 cell line

HUANG Wan-lan

Department of Chemotherapy， Jieyang People′s Hospital， Guangdong Province， Jieyang? ?522000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Paclitaxel （TAX） on proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma with poorly differentiated squamous cell carcinoma HNE1 cell line. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method was used to detect the inhibitory effect of tax on the proliferation of HNE1 cells. TAX 0， 2.5， 5， 10， 20， 40 and 80 nmol/L to HNE1 cells for 12， 24， 36， 48 and 72 h， respectively. TAX of 0 nmol/L was used as the control group. The effect of different concentrations of TAX on the apoptosis of HNE1 cells were detected by flow cytometry and in situ end labeling （TUNEL）. Results The highest proliferation inhibition rate was over 70% at 72 h. The inhibitory rate of TAX （2.5， 5， 10， 20， 40， 80 nmol/L） on the proliferation of HNE1 cells was time-dependent （P<0.05）， but not dose-dependent （P>0.05）. The results of flow cytometry showed that the early and middle late apoptosis rate of HNE1 cells treated with TAX 0， 5， 10， 20 nmol/L for 48 hours was statistically significant （P<0.05）， with concentration dependent. TUNEL showed that the apoptosis indexes of HNE1 cells under TAX 0， 5， 10， 20 nmol/L for 48 hours were significantly different （P<0.05）. Conclusion TAX can inhibit the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma poorly differentiated squamous cell carcinoma HNE1 cell line and induce apoptosis.

[Key words] Paclitaxel; HNE1 cells; Proliferation; Apoptosis

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）為中國(guó)南方常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率為（10～30）/10萬(wàn)[1]。放療或聯(lián)合化放療仍是鼻咽癌的主要治療手段，局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因[2]。紫杉醇（Paclitaxel，TAX）為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移鼻咽癌的常用治療藥物，能夠提高疾病緩解率和局部控制率，但未能提高總生存率[3-6];合適的應(yīng)用方法仍未確定。本研究旨在探討TAX對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系的抗增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，為臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑? TAX購(gòu)于百時(shí)美施貴寶公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于GIBCO公司，胰酶購(gòu)于Sigma公司，新牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基公司，TUNEL試劑盒購(gòu)于德國(guó)Roche公司，DAB試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，分析純二甲基亞砜（DMSO）及四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于美國(guó)AMRESCO公司。

1.1.2細(xì)胞培養(yǎng)? 人鼻咽癌細(xì)胞株HNE1由中南大學(xué)腫瘤研究所提供，細(xì)胞培養(yǎng)用含15%新生牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、95%濕度、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。各組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)不同濃度TAX對(duì)HNE1的增殖抑制作用? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HNE1細(xì)胞，按2×103/孔種植于96孔板，貼壁培養(yǎng)24 h，TAX 0、2.5、5、10、20、40、80 nmol/L 分別作用HNE1細(xì)胞12、24、36、48、72 h后（以TAX 0 nmol/L作為對(duì)照組，其余為實(shí)驗(yàn)組），每孔加入濃度為5 g/L的MTT 20 μl，37°C繼續(xù)孵育4 h，棄MTT液，加入150 μl DMSO，待MTT結(jié)晶充分溶解后，應(yīng)用酶標(biāo)光度儀測(cè)定各孔492 nm的A值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組對(duì)HNE1細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值）/對(duì)照組A值×100%。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度TAX誘導(dǎo)NHE1細(xì)胞的凋亡發(fā)生情況? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HNE1細(xì)胞4瓶，按TAX 0、5、10、20 nmol/L作用NHE1細(xì)胞48 h后，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化， PBS洗滌細(xì)胞2次（離心2000 r/min，5 min），收集1×105個(gè)細(xì)胞，500 μl Binding buffer懸浮細(xì)胞，加入10 μl Annexin V-FITC混勻后加入5 μl Propidium Iodide，室溫避光5 min，用FACSCalibur CV<2流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組、TAX 5、10、20 nmol/L作用NHE1細(xì)胞48 h后HNE1細(xì)胞的凋亡發(fā)生情況。

1.2.3原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測(cè)不同濃度TAX誘導(dǎo)NHE1細(xì)胞的凋亡情況? 實(shí)驗(yàn)處理及細(xì)胞懸液處理同方法“1.2.2”。細(xì)胞懸液離心成團(tuán)制成石蠟團(tuán)塊，4 μm厚連續(xù)切片。按照德國(guó)Roche公司TUNEL試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。顯微鏡下（400×）計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)不同視野的凋亡細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間相差的顯著性比較采用方差分析中的Student-Newman-Keult Q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度TAX對(duì)HNE1細(xì)胞12、24、36、48、72 h增殖抑制率的比較

不同濃度TAX（2.5、5、10、20、40、80 nmol/L）對(duì)HNE1細(xì)胞的增殖抑制率與作用時(shí)間呈時(shí)效關(guān)系（P<0.05），但與藥物濃度未呈量效關(guān)系（P>0.05）（表1）。

2.2不同濃度TAX作用HNE1細(xì)胞48 h的早期及中晚期凋亡率的比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況顯示，TAX 0、5、10、20 nmol/L作用HNE1細(xì)胞48 h的早期及中晚期凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），呈濃度依賴關(guān)系（表2）。

2.3 TUNEL法檢測(cè)HNE1細(xì)胞的凋亡情況

經(jīng)TUNEL法染色后陽(yáng)性物質(zhì)呈棕褐色顆粒，位于細(xì)胞核內(nèi)。凋亡細(xì)胞多呈圓形，少數(shù)形狀不規(guī)則。TAX 0、5、10、20 nmol/L作用HNE1細(xì)胞48 h后的凋亡指數(shù)分別為（2.33±0.58）、（8.33±1.53）、（9.25±2.06）、（18.25±1.26）%，不同濃度之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），呈濃度依賴關(guān)系。

3討論

鼻咽癌是指發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率為頭頸部惡性腫瘤之首。其發(fā)病因素較為多樣，包括遺傳因素、病毒感染、環(huán)境因素等，發(fā)病后患者多伴有鼻塞、涕中帶血、耳悶堵感、聽(tīng)力下降等臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者的身體健康。目前學(xué)界關(guān)于其發(fā)生機(jī)制尚未統(tǒng)一闡明，臨床多認(rèn)為與以下3個(gè)因素存在一定關(guān)系：①遺傳因素。臨床發(fā)現(xiàn)多數(shù)鼻咽癌患者存在家族疾病史，具有垂直和水平的家族發(fā)生傾向。在我國(guó)，該病多發(fā)于廣東、廣西、湖南、福建和江西南方5省，具有明顯的地域集中性。②病毒感染。從鼻咽癌組織中分離出了帶病毒的類淋巴母細(xì)胞株，少數(shù)在電鏡下可見(jiàn)病毒顆粒。③環(huán)境因素。移居國(guó)外的國(guó)人，鼻咽癌死亡率隨著遺傳代數(shù)增加而逐步下降，而出生于東南亞的白種人，鼻咽癌發(fā)病率也有所提升，提示環(huán)境因素在鼻咽癌發(fā)病中起著重要的作用。藥物治療是鼻咽癌治療的常用手段，TAX是近年來(lái)研究開(kāi)發(fā)的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特的新型抗腫瘤藥物，能夠促進(jìn)微血管雙聚體裝配成微管，進(jìn)而阻斷微管蛋白解聚而使微管處于穩(wěn)定狀態(tài)，從而抑制細(xì)胞分裂，起到誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及生長(zhǎng)的作用。查閱知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)學(xué)界關(guān)于TAX治療鼻咽癌的報(bào)道研究近年來(lái)逐步增多，但更多是分析TAX對(duì)癌細(xì)胞的作用，關(guān)于其濃度差異對(duì)鼻咽癌HNE1細(xì)胞增殖、凋亡的影響少有提及。鑒于此，本研究以此為著眼點(diǎn)展開(kāi)對(duì)比研究，結(jié)果顯示，不同濃度TAX對(duì)鼻咽癌HNE1細(xì)胞均有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，增殖抑制呈時(shí)間依賴性，而不存在此濃度范圍的依賴性，然而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡則呈濃度依賴關(guān)系（P<0.05）。

TAX通過(guò)與β微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白組裝和穩(wěn)定微管，阻止微管解聚，干擾細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[7-8]。本研究結(jié)果提示，不同濃度TAX對(duì)鼻咽癌HNE1細(xì)胞均有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，這與文獻(xiàn)報(bào)結(jié)果一致[9-11];其抗鼻咽癌作用也已有臨床研究證實(shí)[12]。但本研究抗增殖作用未存在劑量依賴性，與文獻(xiàn)報(bào)告存在一定的差異，估計(jì)與研究所設(shè)定的劑量濃度范圍差異有關(guān);王承龍等[13]對(duì)鼻咽癌CNE1研究也提示TAX僅在一定劑量范圍內(nèi)有劑量依賴性，但同一劑量有明顯的時(shí)間依賴性，提示一定濃度內(nèi)，TAX的抗腫瘤作用僅呈時(shí)效性，分次給藥可能優(yōu)于單次給藥，并己得到相關(guān)臨床研究證實(shí)。ECOG1199研究[14]發(fā)現(xiàn)在早期乳腺癌術(shù)后輔助治療中，TAX每周給藥明顯優(yōu)于三周方案;Satpute等[15]的研究也提示TAX每周方案能夠提高乳腺癌的病理完全緩解率，同樣在晚期卵巢癌研究中也發(fā)現(xiàn)TAX劑量每周給藥明顯優(yōu)于三周方案，但毒副作用也增加。

綜上所述，TAX對(duì)人鼻咽癌HNE1細(xì)胞系有增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡的作用，其增殖抑制作用可能為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1]張振林.AKR1B10表達(dá)參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究[D].廣州：暨南大學(xué)，2016.

[2]Ma L，Yang Y，Yin Z，et al.Emodin suppresses the nasopharyngeal carcinoma cells by targeting the chloride channels[J].Biomed Pharmacother，2017，90：615-625.

[3]Codd JD，Salisbury JR，Packham G，et al.A20 RNA expression is associated with undifferentiated nasopharyngeal carcinoma and poorly differentiated head and neck squamous cell carcinoma[J].J Pathol，2015，187（5）：549-555.

[4]毛承剛，萬(wàn)俐佳，沈敏，等.鼻咽癌治療后生存率和預(yù)后總結(jié)與分析[J].中國(guó)耳鼻咽喉顱底外科雜志，2015，21（5）：386-389.

[5]楊愛(ài)萍.局部晚期鼻咽癌患者應(yīng)用順鉑聯(lián)合紫杉醇同步放化療的療效觀察[J].中國(guó)婦幼健康研究，2017，28（S3）：23.

[6]顧紅芳，王向前，許春明，等.調(diào)強(qiáng)放療聯(lián)合紫杉醇與順鉑化療治療局部晚期鼻咽癌的臨床療效[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2014，14（27）：78-79.

[7]吳薇，羅輝，李暉，等.紫杉醇同期放化療治療局部晚期鼻咽癌的臨床研究[J].江西醫(yī)藥，2014，14（1）：19-21.

[8]Choron RL，Chang S，Khan S，et al.Paclitaxel impairs adipose stem cell proliferation and differentiation[J].J Surg Res，2015， 196（2）：404-415.

[9]Ohnishi Y，Watanabe M，Yasui H，et al.Effects of epidermal growth factor on the invasive activity and cytoskeleton of oral squamous cell carcinoma cell lines[J].Oncol Lett，2014，7（5）：1439-1442.

[10]王秀，劉健，張競(jìng)競(jìng)，等.17-DMAG對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株HNE1增殖與凋亡的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2017， 22（5）：490-494.

[11]張配，劉芳，高嬌，等.抑制單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP對(duì)順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（7）：883-888.

[12]劉敏.姜黃素聯(lián)合TAX對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用[D].山東：山東大學(xué)，2017.

[13]王承龍，張帥，趙素萍.紫杉醇聯(lián)合熱療治療小鼠鼻咽癌CNE-2移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012， 22（34）：7-13.

[14]Xu Y，Li L.Primary squamous cell carcinoma arising from endometriosis of the ovary：a case report and literature review[J].Curr Probl Cancer，2018，42（3）：12-13.

[15]Satpute PS，Hazarey V，Ahmed R，et al.Cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma：a review[J].Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（10）：5579-5587.

（收稿日期：2018-11-22? 本文編輯：閆? 佩）