馮東英 楊 寧 劉 爽 戴洪琨 賈傳福 杜新永

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252000）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬擔(dān)子菌綱多孔菌目多孔菌科靈芝屬，是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，具有較高的藥用價值和經(jīng)濟價值。近年來文獻報道表明，靈芝多糖是靈芝中最重要的活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等[1-3]多種功效。而且，毒理學(xué)臨床實驗表明，靈芝多糖不會對人體健康造成負面影響[4]。

培養(yǎng)基對于靈芝菌絲生長、多糖產(chǎn)量有顯著的影響。靈芝液體深層發(fā)酵，一般選擇蛋白胨、酵母泥、麩皮、米糠[5-8]等作為培養(yǎng)基，也有采用中藥渣[9]，均取得了不錯的結(jié)果。試驗選擇了酵母泥、黃豆粉、玉米粉、麩皮以及中藥藥渣作為培養(yǎng)基主要成分，對靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期獲得最佳的靈芝多糖高產(chǎn)配方。

1 材料與方法

1.1 供試材料

靈芝菌種（泰山赤芝），由山東聊城冠縣靈芝栽培基地提供；蛋白胨為國藥集團產(chǎn)品，自購；中藥渣由青島潤達生物科技有限公司提供；酵母泥由杭州美亞生物科技有限公司提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

靈芝基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，去離子水1000 mL。

供試培養(yǎng)基（酵母泥、玉米粉、黃豆粉、麩皮、雜木屑、黃芪藥渣、甘草藥渣、金銀花藥渣）按干重20 g/L的量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，為保證發(fā)酵效果，保留5 g/L的蛋白胨，其他成分比例不變。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同培養(yǎng)基液體發(fā)酵培養(yǎng)試驗

將試管菌種接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基（500 L錐形瓶，裝入液體培養(yǎng)基200 mL）中，25℃搖瓶培養(yǎng)3 d后，作為種子培養(yǎng)基，按5%接種量，分別接入試驗培養(yǎng)基中（500 L錐形瓶，裝液量200 mL），相同條件下培養(yǎng)3 d。

1.3.2 培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗

根據(jù)1.3.1試驗結(jié)果，按照來源廣泛、物美價廉的原則，選擇黃豆粉、酵母泥、葡萄糖進行三因素、三水平的正交優(yōu)化試驗。

1.4 測定方法

1.4.1 發(fā)酵液pH

pH檢測采用玻璃電極檢測。

1.4.2 菌絲球個數(shù)的統(tǒng)計

用剪掉尖頭的5 mL移液槍，吸取發(fā)酵完成（72 h）的靈芝發(fā)酵液10 mL，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中計數(shù)。

1.4.3 菌絲體生物量

離心（3000×g，20 min）后，50℃烘干沉淀，減去對照值后計算。

1.4.4 靈芝多糖的提取與得率計算

靈芝多糖提取采用熱水浸提，噴霧干燥后測定得率。取干燥的靈芝菌絲體100 g，加1000 mL水，煮沸后維持1 h，離心（3000×g，20 min）去掉沉淀后，上清液噴霧干燥（進風(fēng)口175℃、出風(fēng)口80℃、處理速度240 mL/h）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

生長指標(biāo)相關(guān)性分析、正交試驗設(shè)計、單因素顯著性分析等，均用SPSS完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試培養(yǎng)基靈芝液體培養(yǎng)結(jié)果

從靈芝液體深層發(fā)酵的生產(chǎn)指數(shù)來看，發(fā)酵液pH的下降是靈芝菌絲開始迅速生長的重要指標(biāo)之一，但是，pH的下降以及發(fā)酵結(jié)束的pH與靈芝多糖的得率之間的相關(guān)性不強。從表1中可以看出，pH下降速度最快的分別是麩皮、玉米粉，但是麩皮培養(yǎng)基的靈芝多糖得率低于基礎(chǔ)培養(yǎng)基（77%，按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基為100%，下同），玉米粉培養(yǎng)基的靈芝多糖得率略高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基（108%）。郭天龍采用米糠、麩皮作為主要原料液體培養(yǎng)靈芝，獲得10.37 g/L的菌絲體生物量，4.279 g/L、7.644 g/L的胞內(nèi)和胞外靈芝多糖[5]。試驗多糖得率較低，可能與發(fā)酵液pH下降太快有關(guān)系。程秀芳等對六株來源于不同地區(qū)的靈芝菌株同條件液體發(fā)酵，確定了pH3.5～4.5，鏡檢菌絲出現(xiàn)少量自溶點時作為發(fā)酵終點，此時靈芝胞內(nèi)多糖含量最高[10]。

試驗發(fā)酵結(jié)束后，不同培養(yǎng)基的最終pH在4.39～5.23，靈芝多糖得率較高的黃豆粉（145%）、酵母泥（123%）培養(yǎng)基的最終pH均在4.8左右。張曉云采用酵母浸粉為主要原料培養(yǎng)龍芝一號，獲得了6.28 g/L的菌絲體生物量和1.68 g/L的胞內(nèi)靈芝多糖[7]。陳功明選擇了酵母粉作為主要培養(yǎng)基，培養(yǎng)赤芝，獲得了11.26 g/L的菌絲體生物量和1.63 g/L的胞內(nèi)靈芝多糖[5]。從表1中可以看出，試驗采用酵母泥作為主要培養(yǎng)基成分時，獲得了9.04 g/L的菌絲體生物量，以及1.89 g/L的靈芝多糖，與上述文獻報道具有一定的吻合度，說明酵母泥是靈芝深層發(fā)酵的優(yōu)選培養(yǎng)基之一。

從表1的數(shù)據(jù)可以看出，試驗最佳的培養(yǎng)基為黃豆粉，同樣培養(yǎng)條件下，獲得了13.09 g/L的菌絲體生物量和2.24 g/L靈芝多糖。

2.2 靈芝菌絲生長性狀與多糖得率相關(guān)性分析

結(jié)合表1的數(shù)據(jù)以及相關(guān)報道[8]，可以看出靈芝發(fā)酵過程中，菌絲球的個數(shù)與靈芝菌絲體生物量、靈芝多糖得率具有較好的相關(guān)性。喬雙逵等觀察分析了靈芝深層發(fā)酵時，菌絲球的大小及個數(shù)與菌絲體產(chǎn)量、靈芝多糖得率關(guān)系，結(jié)論是中小型菌球比例較高時有利于胞外多糖的合成，并且小型菌球比例大于大型菌球時，發(fā)酵液中多糖含量較高[12]。

由圖1、表2可見，菌絲球個數(shù)、菌絲體生物量、靈芝多糖得率三者之間均具有較好的正向相關(guān)性。以靈芝多糖得率為評價標(biāo)準(zhǔn)，則菌絲體生物量與靈芝多糖得率具有極顯著的相關(guān)性（0.829）、而菌絲球個數(shù)與靈芝多糖得率也具有顯著的相關(guān)性（0.789），皮爾森（Person）雙尾檢驗標(biāo)準(zhǔn)為（P＜0.01）。

圖1 靈芝菌絲生長性狀與多糖得率相關(guān)性分析散點圖

表1 供試培養(yǎng)基靈芝液體培養(yǎng)結(jié)果

表2 靈芝菌絲生長性狀與多糖得率相關(guān)性分析

2.3 正交法優(yōu)化培養(yǎng)基配方

根據(jù)前期試驗結(jié)果，去掉培養(yǎng)基中的蛋白胨成分，選擇黃豆粉、酵母泥、葡萄糖作為靈芝深層發(fā)酵的主要培養(yǎng)基，同時參照1.3.1“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”添加相應(yīng)的無機鹽，利用SPSS進行培養(yǎng)基正交優(yōu)化設(shè)計。因素水平見表3。

表3 正交試驗的因素水平

按照表4的正交方案進行試驗，記錄靈芝多糖的得率。極差分析方法結(jié)論是，靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中，對靈芝多糖產(chǎn)量的影響因素次序是黃豆粉＞葡萄糖＞酵母泥，最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A3B1C3，即：黃豆粉15 g/L，酵母泥5 g/L，葡萄糖20 g/L，添加 KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始pH為6.0左右。

表4 正交試驗結(jié)果

參照上述配方，按照1.3.1所述條件搖瓶培養(yǎng)靈芝，最終的靈芝多糖得率為4.99%，略低于表4中試驗4，可能跟試驗操作的誤差有關(guān)。

表5的統(tǒng)計分析結(jié)果與表4的極差分析結(jié)果基本相同，其中，黃豆粉用量的顯著性為0.007，符合P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，即黃豆粉用量對靈芝多糖的產(chǎn)量具有顯著性影響；而葡萄糖、酵母泥用量的顯著性檢驗值均高于0.05，即這兩種培養(yǎng)基對于靈芝多糖的最終得率不具有顯著性影響。

表5 主旨間效果檢定（響應(yīng)值：靈芝多糖得率/%）

綜上所述，結(jié)合經(jīng)濟性的原則，在盡量減少培養(yǎng)基用量的情況下，獲得最大的產(chǎn)出，試驗最終確定的培養(yǎng)基配方為表4的第4個試驗設(shè)計，即黃豆粉10 g/L，酵母泥5 g/L，葡萄糖10 g/L，添加KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

依照上述配方，利用100 L發(fā)酵罐進行驗證試驗（26℃、發(fā)酵72 h），最終收獲靈芝多糖130 g，固體投料量為2650 g，折合靈芝多糖得率為4.9%。

3 小結(jié)

靈芝液體發(fā)酵過程中，發(fā)酵液pH的降低是靈芝菌絲開始迅速生長的標(biāo)志，但是pH的變化與靈芝多糖的得率沒有相關(guān)性。靈芝菌絲球個數(shù)與菌絲體生物量與靈芝多糖的得率有著顯著的正相關(guān)性（0.789，0.829），說明提高靈芝液體發(fā)酵過程中菌絲球數(shù)量可以提高靈芝多糖的得率。

黃豆粉、酵母泥都是靈芝液體培養(yǎng)獲取多糖良好培養(yǎng)基；試驗中采用的中藥渣對于靈芝菌絲的生長均有一定的抑制效果，發(fā)酵效果不理想。

經(jīng)過正交優(yōu)化，得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：黃豆粉 10 g/L，酵母泥 5 g/L，葡萄糖 10 g/L，添加KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。100 L發(fā)酵罐進行驗證試驗（26℃、發(fā)酵72 h），最終收獲靈芝多糖噴霧干燥粉130 g（得率4.9%）。