毛湘君芝 陸震鳴 耿燕 許泓瑜 袁峰 趙伏梅 徐國華 史勁松 許正宏，3

（1江南大學藥學院，江蘇無錫214122；2江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；4江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇淮安211600）

猴頭菌（Hericium erinaceus），又稱猴頭菇，隸屬于擔子菌門、猴頭菌科、猴頭菌屬，是著名的藥食兩用真菌。根據《本草綱目》和《中華本草》記載，猴頭菌性平、味甘，有“利五臟、助消化”的功能[1-2]。猴頭菌脂肪含量低，富含蛋白質、多糖和膳食纖維。它也是必需氨基酸、酚類化合物和微量營養(yǎng)素的良好來源[3]?，F(xiàn)代研究表明，猴頭菌的子實體、菌絲體及其提取物有多種生物學活性，如保護胃腸道、抗腫瘤、降糖降壓、保肝、抗衰老、抗菌和神經保護作用[4]。目前臨床上主要用于治療胃和十二指腸潰瘍、慢性胃炎和消化道腫瘤等[5-6]。

袋料栽培是目前人工栽培猴頭菌子實體最常用的方法，但這種方法生產周期長、費用較高、且可能存在潮次不穩(wěn)定的現(xiàn)象。而將液態(tài)深層發(fā)酵技術應用于猴頭菌的生產，能縮短生產周期、降低成本、提高產品穩(wěn)定性，并且易于實現(xiàn)工廠化生產。目前，關于猴頭菌子實體及其提取物的藥效評價相關研究越來越多，但對液態(tài)深層發(fā)酵生產猴頭菌絲粉的護胃功能研究較少。筆者旨在探討猴頭菌粉對小鼠急性酒精性胃損傷的預防作用，為猴頭菌粉的進一步開發(fā)利用提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

猴頭菌粉由江蘇神華藥業(yè)有限公司采用深層液態(tài)發(fā)酵法生產，符合國家藥品標準[7]；西咪替丁購于青島捷世康生物科技有限公司。

試驗動物：6周齡雄性C57BL/6小鼠，18～22 g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 試劑與儀器設備

蘇木素伊紅染色試劑盒（碧云天生物技術公司）；丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程有限公司）；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；TRIzol試劑（美國Roche公司）；SYBR Select Master Mix（美國Thermo公司）；微量pH計（Mettler Toledo公司）；RM2245半自動輪轉切片機（德國Leica公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 動物模型的建立和樣品的采集

雄性C57BL/6小鼠48只，隨機分為空白組、模型組、陽性組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，共6組，每組8只?？瞻捉M、模型組小鼠灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液；陽性組藥物為西咪替丁，給藥劑量為100 mg/kg；猴頭菌粉低、中、高劑量組分別為 125 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg，所有藥物均溶于0.5%CMC-Na溶液中。每日灌胃給藥1次，連續(xù)6 d，第6天給藥后禁食24 h，不禁水。第7天除空白組外，其他各組給藥90 min后用無水乙醇0.1 mL/10 g灌胃，4 h后處死，取胃組織用于后續(xù)試驗。

1.4 胃液pH的測定

用微量pH計測量小鼠胃液pH。

1.5 胃黏膜損傷情況的肉眼觀察

將小鼠全胃沿胃大彎剪開，用冷生理鹽水漂洗內容物。將胃組織攤平，胃內表面朝上，對胃黏膜的損傷情況進行肉眼觀察，評價胃黏膜完整性及出血情況。

1.6 胃黏膜組織病理學檢查

將小鼠胃組織置于10%甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，將其切成4μm薄片。用蘇木素伊紅染色試劑盒染色，中性樹膠封片，然后在顯微鏡下觀察。根據胃黏膜細胞脫落（0～3分）、出血（0～4分）、水腫（0～4分）、炎細胞浸潤（0～3分）情況進行評分[8]。

1.7 胃組織中丙二醛（MDA）的測定

取小鼠胃組織，用丙二醛（MDA）測定試劑盒檢測MDA含量。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.8 胃組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）mRNA表達量的測定

用TRIzol試劑提取小鼠胃組織RNA，用cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。使用SYBR Mix試劑和特異性引物進行qRT-PCR。以GAPDH為內參，用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

引物序列如下：TNF-α上游引物5′-GACCCCTTTACTCTGACCCC-3′，下游引物5′-AGGCTCCAGTGAATTCGGAA-3′；IL-1β上游引物5′-ACTCATTGTGGCTGTGGAGA-3′，下游引物5′-TTGTTCATCTCGGAGCCTGT-3′；GAPDH 上游引物5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

qRT-PCR反應體系：上游引物（5μmol/L），0.425μL；下游引物（5μmol/L），0.425μL；cDNA，1.25 μL；SYBR Green Mix，8.5 μL；RNase-free H2O，6.4 μL。反應條件為：95°C預變性，10 min，95°C變性，15 s，60°C退火，30 s，60°C 延伸，30 s，共 40個循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計分析

用GraphPad Prism軟件進行數據分析，試驗結果用平均值±標準誤（SEM）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 小鼠胃黏膜的肉眼觀察

小鼠胃壁內部胃黏膜如圖1所示。正常組小鼠胃黏膜光澤紅潤，完整無損傷（圖1a）。乙醇灌胃后模型組小鼠胃黏膜表面有明顯出血、損傷潰爛（圖1b）。猴頭菌粉低、中、高劑量組以及陽性組，胃黏膜有部分出血，但損傷程度減輕（圖1c-f）。

圖1 猴頭菌粉對小鼠胃黏膜損傷程度的影響

2.2 小鼠胃黏膜的組織病理學觀察

圖2 猴頭菌粉對小鼠胃黏膜組織病理學變化的影響

表1 胃黏膜組織病理學變化各項得分

正常組小鼠胃黏膜各層結構完整清晰，細胞形態(tài)完整，腺體排列規(guī)則，未見組織缺損、出血、炎癥等異常病變（圖2a）。模型組小鼠黏膜層細胞彌散性壞死脫落情況嚴重，黏膜層中可見大量紅細胞，細胞腫大、排列松散，有炎細胞浸潤（圖2b）。陽性組小鼠部分黏膜上皮細胞壞死脫落，部分細胞排列松散，黏膜層中有少量紅細胞，有少量炎細胞浸潤（圖2c）。猴頭菌粉低、中、高劑量組小鼠胃黏膜形態(tài)與模型組相比都有不同程度改善（圖2d-f）。對小鼠胃黏膜細胞脫落、出血、水腫、炎細胞浸潤情況分別進行評分（表1），分數越高表明損傷越嚴重。猴頭菌粉低、中、高劑量組胃黏膜組織病理學變化各項得分之和分別為8.00±0.13、7.75±0.17、5.50±0.09，與模型組（9.63±0.06）相比分別降低了16.93%、19.52%、42.89%（圖3）。其中高劑量組差異最顯著（P＜0.001），胃黏膜形態(tài)更接近正常組。

圖3 胃黏膜組織病理學變化評分

圖4 猴頭菌粉對小鼠胃液pH的影響

2.3 小鼠胃液pH

如圖4，模型組小鼠胃液pH為6.33±0.06，與正常組有顯著性差異（P＜0.001），表明乙醇會對胃液pH產生影響。而陽性組、猴頭菌粉低中高劑量組小鼠胃液pH為6.79±0.03、6.67±0.04、6.76±0.06、6.88±0.03，與模型組沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 小鼠胃組織中MDA含量

模型組小鼠胃組織中MDA含量達到（5.46±0.10）nmol/mg，是正常組的2.45倍。表明酒精能使小鼠胃組織中MDA含量大幅度增加，引起組織損傷。而陽性組、猴頭菌粉低、中、高劑量組小鼠胃組織中MDA含量分別為（4.55±0.08）nmol/mg、（4.97±0.15）nmol/mg、（4.77±0.09）nmol/mg、（4.53±0.13）nmol/mg，比模型組略少，但沒有顯著性差異（P＞0.05）（圖5）。表明猴頭菌粉對酒精引起的MDA含量增加有一定的緩解作用。

圖5 猴頭菌粉對小鼠胃組織中MDA的影響

2.5 小鼠胃組織TNF-α和IL-1β mRNA的表達量

模型組、陽性組、猴頭菌粉低、中、高劑量組小鼠胃組織中，TNF-α mRNA表達量分別是正常組的11.6、5.6、5.9、5.3和4.3倍（圖6a、b）。與模型組相比，猴頭菌粉低、中、高劑量小鼠胃組織中TNF-α mRNA表達量分別下降了49.0%、54.6%、63.1%，差異顯著（P＜0.05）。模型組、陽性組、猴頭菌粉低、中、高劑量組小鼠胃組織中，IL-1β mRNA表達量分別是正常組的6.8、3.0、4.9、3.8和3.5倍。與模型組相比，猴頭菌粉低、中、高劑量小鼠胃組織中IL-1β mRNA表達量分別下降了27.8%、43.9%、48.3%。

圖6 猴頭菌粉對小鼠胃組織TNF-α和IL-1β mRNA表達量的影響

3 小結與討論

采用無水乙醇灌胃導致的小鼠急性胃損傷模型，探究猴頭發(fā)酵菌粉對胃黏膜的保護作用。該模型制作簡便、成模速度快，其損傷特點、愈合過程與人胃黏膜損傷類似[9]。

酒精引起的胃損傷常伴有氧化應激及炎癥反應。丙二醛是由多不飽和脂肪酸的脂質過氧化產生的，是氧化應激的標志物。因此，脂質過氧化程度及機體的氧化應激水平可以通過組織中丙二醛的含量進行評估。此外，研究表明，酒精會激活機體的免疫系統(tǒng)從而影響促炎因子的水平，包括TNF-α和IL-1β[10]。TNF-α作為一種具有多種功能的重要細胞因子，與其他炎癥因子（如IL-1β和IL-6）的活化密切相關，參與炎性疾病的發(fā)展[11]。而IL-1β和IL-6的激活會進一步促進TNF-α的表達，加劇炎癥反應。TNF-α是致炎最強的因子之一，因此常作為判斷炎癥程度的指標。

以不同劑量的猴頭菌粉連續(xù)灌胃小鼠6 d后，觀察乙醇灌胃后小鼠胃黏膜的損傷情況。檢測小鼠胃液pH、胃組織MDA含量、TNF-α和IL-1β mRNA的表達情況，結合胃組織病理學檢查，評價猴頭菌粉對急性酒精性胃損傷的保護作用，初步探究猴頭菌粉保護胃黏膜的機制。結果表明，模型組小鼠胃黏膜可見明顯出血、潰爛、細胞壞死脫落情況，胃液pH明顯升高，胃組織MDA含量顯著增加，胃組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達量明顯增加。灌胃猴頭菌粉能顯著改善小鼠胃黏膜中出血、潰爛、細胞壞死脫落情況，胃組織MDA含量略有下降，但對酒精引起的pH升高沒有顯著影響。而小鼠胃組織中TNF-α和IL-1β mRNA含量明顯少于模型組，提示猴頭菌粉可能通過抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達，從而減輕炎癥反應，減少酒精對胃黏膜的損傷，達到保護胃黏膜的效果。