周連玉 更尕求卓 唐德華 米 琴

（青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海西寧810008）

目前食物向多樣化發(fā)展，人們已注意膳食的合理搭配以及常量元素與微量元素的攝入比例。在缺乏的必需微量元素中，硒缺乏就在其中之一，硒是人體谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性成分，硒能調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)速度，強(qiáng)化某些酶系統(tǒng)的活性及調(diào)節(jié)維生素A、C、E、K在體內(nèi)吸收和消化；還可對(duì)汞、鎘等重金屬具有解毒作用[1]。無(wú)機(jī)硒在體內(nèi)不易吸收且毒性強(qiáng)，人體對(duì)有機(jī)硒的吸收率比無(wú)機(jī)硒高30%，毒性也小，并且可以在人體組織內(nèi)儲(chǔ)存[2]。而許多生物能使添加的外源無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為易被體內(nèi)吸收利用的有機(jī)硒。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，杏鮑菇、靈芝、雞腿菇、平菇、灰樹花等多種食藥用菌具有較強(qiáng)的富硒能力，然而不同種蕈菌液體耐硒能力有差別，其菌絲體生長(zhǎng)受菌株特性、培養(yǎng)基、硒濃度、加硒時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間、pH、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量等多種因素的影響[3-7]。有許多研究表明：不同菌株在一定硒濃度下富硒后能提高發(fā)酵液或菌絲體的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及活性作用[8-11]，還轉(zhuǎn)化硒的形態(tài)[4]，因此可作為補(bǔ)硒營(yíng)養(yǎng)品和應(yīng)用于高附加值的食品中[12-13]。

黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens）是一種大型真菌，隸屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，口蘑目，口蘑科，蜜環(huán)菌屬。在青海主要生長(zhǎng)在海拔3000～4300 m的草甸上，大多分布于海北（祁連、海晏、剛察）、黃南（澤庫(kù)、河南）、海南（共和、貴德、興海）、果洛（瑪沁、甘德、久治）及高海拔的玉樹地區(qū)；以及四川、西藏、河北、陜西、甘肅等省區(qū)也有分布[14]。目前黃綠蜜環(huán)菌還屬于野生菌，因此無(wú)法進(jìn)行人工栽培。研究多集中于其生物學(xué)特征、人工培養(yǎng)、化學(xué)成分分析、分子鑒定、生態(tài)特性等方面[15-24]。利用黃綠蜜環(huán)菌生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)特定物質(zhì)的相關(guān)報(bào)道很少，在一定轉(zhuǎn)化體系中黃綠蜜環(huán)菌可生物轉(zhuǎn)化合成天麻素[25-26]，LIU J等[27]發(fā)現(xiàn)黃綠蜜環(huán)菌ZJUUQH100-6菌株在適宜條件下可以將白樺脂醇轉(zhuǎn)化合成白樺脂酸。試驗(yàn)研究亞硒酸鈉對(duì)黃綠蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)菌絲體生物量的影響，旨在為黃綠蜜環(huán)菌富硒的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

黃綠蜜環(huán)菌菌株HM，由青海師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化菌株采用PDA培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL。種子培養(yǎng)基采用PDB，配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖4%，牛肉膏0.10%，KH2PO40.10%，MgSO40.10%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液體菌種的制備

250 mL三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基100 mL，將3塊4 mm的菌塊接到培養(yǎng)液中，于25℃培養(yǎng)4 d。

1.2.2 不同硒濃度對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

以15%的接種量將液體菌種接到含亞硒酸鈉的濃度分別為0 mmol∕L（CK）、0.20 mmol∕L、0.40 mmol∕L、0.60 mmol∕L、0.80 mmol∕L、1.00 mmol∕L 的發(fā)酵培養(yǎng)基中。25℃培養(yǎng)8 d，測(cè)定富硒黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量。每個(gè)濃度設(shè)三次重復(fù)。

1.2.3 添加硒時(shí)間對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

以15%的接種量將液體菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，以上述試驗(yàn)確定的適宜硒濃度后，將分別在0 d、2 d、4 d、6 d時(shí)將亞硒酸鈉添加到發(fā)酵培養(yǎng)基，重復(fù)3次。25℃培養(yǎng)8 d，測(cè)定富硒黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量。

1.2.4 硒對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體動(dòng)態(tài)性的影響

以最適硒濃度、最適添加硒時(shí)間進(jìn)行黃綠蜜環(huán)菌深層富硒動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。分別以添加亞硒酸鈉和不加硒的發(fā)酵培養(yǎng)基為富硒處理組與對(duì)照組，25℃培養(yǎng)，在發(fā)酵時(shí)間5 d、6 d、7 d、8 d時(shí)，分別對(duì)富硒處理組與對(duì)照組進(jìn)行取樣，重復(fù)三次，測(cè)定黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量。

1.3 菌絲體生物量的測(cè)定

培養(yǎng)液過(guò)濾獲得菌絲體和發(fā)酵液，并用蒸餾水反復(fù)清洗菌絲體至濾液無(wú)色，菌絲體于60℃干燥至恒重，電子天平稱重測(cè)得菌絲體生物量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，不同硒濃度處理下菌絲體生物量和不同加硒時(shí)間下菌絲體生物量差異性比較用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD，P＜0.05）。加硒組和對(duì)照組菌絲體生物量動(dòng)態(tài)性的顯著性通過(guò)獨(dú)立樣本的t-test進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒濃度對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

不同硒濃度對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖1所示。供試黃綠蜜環(huán)菌菌絲在5種加硒培養(yǎng)基里均能生長(zhǎng)，而硒濃度為0.80 mmol∕L能顯著提高黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量（P＜0.05），但其他硒濃度與對(duì)照之間不存在顯著性差異。

圖1 不同硒濃度對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

2.2 不同加硒時(shí)間對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

由2.1試驗(yàn)結(jié)果確定適宜硒濃度為0.80 mmol∕L，探討不同加硒時(shí)間對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的研究，結(jié)果如圖2所示，與不加硒相比，除第6天時(shí)加硒組與不加硒組之間不存在顯著性差異，其他時(shí)間加硒顯著提高黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量（P＜0.05），而第4天加硒菌絲體生物量增長(zhǎng)最大，達(dá)到9.32%。

圖2 不同加硒時(shí)間對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

2.3 硒對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量累積動(dòng)態(tài)的影響

黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量動(dòng)態(tài)變化如圖3所示，富硒組與對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)規(guī)律基本一致。于發(fā)酵時(shí)間5 d、6 d、8 d時(shí)加硒組與不加硒兩者之間的菌絲體生物量干重不存在顯著性差異。與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)時(shí)間第7天時(shí)硒顯著提高黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量（P＜0.05），且增長(zhǎng)幅度達(dá)到33.33%。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間硒對(duì)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

3 小結(jié)與討論

食藥用菌富硒菌絲體生物量與硒濃度密切相關(guān)，硒濃度不同所起到促進(jìn)或抑制的作用也各異[6-7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加硒后，黃綠蜜環(huán)菌的菌球呈現(xiàn)紅色（有些菌球內(nèi)層紅色外層為白色），當(dāng)硒濃度0.80 mmol∕L時(shí)，顯著提高菌絲體生物量的含量（P＜0.05，圖1），可見，在適宜硒濃度下可促進(jìn)黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長(zhǎng)。

將濃度為100 μg∕mL亞硒酸鈉分別于第1天、第3天、第5天加到靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)果加硒時(shí)間為第1天時(shí)，靈芝菌絲體生物量最高且發(fā)酵液的顏色正常為淺黃色[28]。發(fā)現(xiàn)在黃綠蜜環(huán)菌培養(yǎng)第4天時(shí)加0.80 mmol∕L亞硒酸鈉顯著提高菌絲體生物量（P＜0.05，圖2）。

張炎灼等[29]通過(guò)添加3 μg∕mL亞硒酸鈉于秀珍菇液體培養(yǎng)基中研究菌絲體動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與富硒組生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，于培養(yǎng)72 h時(shí)菌絲體生物量達(dá)到最大值，分別為1.81 mg∕mL和1.92 mg∕mL，但兩者之間不存在顯著性差異。發(fā)現(xiàn)黃綠蜜環(huán)菌于發(fā)酵時(shí)間7 d時(shí)，富硒組菌絲體生物量顯著高于對(duì)照組，而在發(fā)酵時(shí)間5 d、6 d和8 d時(shí)富硒組生物量略大于對(duì)照組（P＜0.05，圖3），這一結(jié)果也表明了適當(dāng)硒濃度能促進(jìn)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生長(zhǎng)。

總之，硒對(duì)食藥用菌菌絲體生物量有明顯的影響，有關(guān)硒對(duì)黃綠蜜環(huán)菌營(yíng)養(yǎng)成分的作用有待于進(jìn)一步研究。