徐 慧，陳發(fā)榮，王保娟，王 永，石 磊，陳 洵，常彥磊，時(shí)國強(qiáng)，6，張 偉

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定 071001；2.北京艾旗斯德科技有限公司，北京 101102；3.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津 300232；4.暨南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東廣州 510632；5.廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司，廣東廣州 510320；6.河北三獅生物科技有限公司，河北石家莊 050011）

沙門氏菌（Salmonella） 是一種常見的食源性致病菌，屬腸桿菌科、革蘭氏陰性腸道桿菌[1]，主要寄生于人類和動(dòng)物腸道中，可致食物中毒、慢性腸炎、腸熱癥等[2]。因沙門氏菌經(jīng)常存活于肉制品、蛋類、水產(chǎn)品中，在20℃以上即能大量繁殖，世界各國普遍規(guī)定食品中不得檢出沙門氏菌[3]。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，人攝入含有一定量沙門氏菌（1×106～1×107CFU/g）的動(dòng)物性產(chǎn)品后易引發(fā)細(xì)菌性感染，我國每年細(xì)菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起的[4-5]。

目前，常用的沙門氏菌檢測方法有傳統(tǒng)方法如國家標(biāo)準(zhǔn)、AOAC等，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法如酶聯(lián)免疫法（ELISA）等，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 等[6]。傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時(shí)間較長，一般需要3～4 d檢測時(shí)間[7]。ELISA方法從樣品的制備到檢測結(jié)束大概要40～48 h才能完成，且由于使用的多價(jià)血清存在不同程度的交叉反應(yīng)，容易產(chǎn)生假陽性[8]。PCR方法需要昂貴的PCR儀器和繁瑣的電泳，故不宜普遍推廣。因此，亟需開發(fā)一種快速檢測食品中沙門氏菌的檢測方法，對于保障我國食品安全具有重要意義。

研究在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）[9]基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光染料SYBR Green I建立的一種實(shí)時(shí)熒光LAMP（RF-LAMP）技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的快速檢測提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗(yàn)所用菌株包括甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、大腸桿菌O157∶H7、產(chǎn)氣莢膜桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌。

1.1.2 樣品

肉制品，購自保定市某超市。

1.1.3 主要培養(yǎng)基和試劑

營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；Bst DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs，大連寶生物工程有限公司提供；熒光試劑，Sigma公司提供；實(shí)時(shí)熒光LAMP內(nèi)、外引物，合成于大連寶生物工程有限公司；DNA提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.4 主要儀器

WH-861型旋渦混合器，太倉市科教器材廠產(chǎn)品；數(shù)顯超級恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；QYC-200型全溫?fù)u床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測儀，德國ESE Gmbh公司產(chǎn)品；TGL-16G型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 純菌的培養(yǎng)

取保藏的菌株接種于滅菌的NB液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.2 DNA模板的制備

研究采用熱裂解法進(jìn)行DNA模板的提取。取過夜培養(yǎng)的菌懸液1.5 mL于滅菌離心管中，以轉(zhuǎn)速11 000 r/min離心1 min，棄去上清液。加入300 μL無菌蒸餾水洗滌菌體沉淀，重復(fù)2次，然后加入100 μL無菌蒸餾水，使菌體充分振蕩懸?。辉诜兴≈袑⒕鷳乙褐蠓?0 min，然后以轉(zhuǎn)速11 000 r/min離心1 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新的滅菌離心管中，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

研究選取Genebank中已經(jīng)公布的沙門氏菌inv基因作為靶基因。

實(shí)時(shí)熒光LAMP所用引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光LAMP所用引物

1.2.4 RF-LAMP反應(yīng)體系

總反應(yīng)體系 （25 μL） 包括 2.5 μL 10×Bst buffer，1 μL鎂離子（50 mmol），5 μLdNTPs（2.5 mmol）混合物，1 μLBst酶（8 000 U/mL），1 μL甜菜堿（5 mol），1.5 μL 模板 DNA，0.5 μL SYBR，F(xiàn)IP 和 BIP 引物（10 mmol）各2.5 μL，F(xiàn)3和B3引物（10 mmol）各0.5 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足體積至 25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為61℃條件下反應(yīng)1 h。

1.2.5 RF-LAMP的特異性

采用熱裂解法對表1中15株菌進(jìn)行基因組DNA提取。陰性對照用無菌蒸餾水代替模板。按照優(yōu)化好的RF-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增來驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.6 RF-LAMP檢測純菌的靈敏度

以編號(hào)為CMCC 50041的腸炎沙門氏菌作為試驗(yàn)菌種進(jìn)行靈敏度和檢出限的檢測。將過夜培養(yǎng)的新鮮菌液進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測得菌液濃度為5.6×109CFU/mL。用無菌生理鹽水對其進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到連續(xù)稀釋的腸炎沙門氏菌懸液。取1 mL各稀釋梯度的菌懸液提取基因組DNA，并進(jìn)行RFLAMP方法的靈敏度試驗(yàn)。

1.2.7 RF-LAMP檢測人工污染肉制品的檢出限

取25 g經(jīng)國標(biāo)法檢測無沙門氏菌的肉制品加入到225 mL的無菌生理鹽水中，制成勻漿液，取9 mL加到離心管（10 mL） 中，分別將10倍梯度稀釋的菌懸液（5.1×107～5.1×102CFU/mL） 各1 mL加到上述離心管中，混勻，得到不同濃度的菌液勻漿。用1.2.2中所述熱裂解法提取基因組DNA，并用RF-LAMP方法驗(yàn)證人工污染肉制品中沙門氏菌的檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 RF-LAMP的特異性

實(shí)時(shí)熒光LAMP引物特異性的檢測結(jié)果見表2。

從表2中可以看出，用于RF-LAMP特異性試驗(yàn)的15株試驗(yàn)菌株中，4株沙門氏菌檢測結(jié)果為陽性；其他11株非沙門氏菌檢測結(jié)果為陰性，結(jié)果表明該研究建立的方法特異性強(qiáng)。

表2 實(shí)時(shí)熒光LAMP引物特異性的檢測結(jié)果

2.2 RF-LAMP檢測純菌的靈敏度

實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測沙門氏菌的靈敏度見圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測沙門氏菌的靈敏度

由圖1可以看出，當(dāng)沙門氏菌純培養(yǎng)物濃度為5.6×105CFU/mL～5.6×101CFU/mL時(shí)，熒光曲線出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增峰，儀器自動(dòng)判定為陽性；當(dāng)濃度為5.6×100CFU/mL時(shí)，熒光曲線平緩，未出現(xiàn)擴(kuò)增峰，判定為陰性。因此，研究所建立RF-LAMP檢測沙門氏菌的靈敏度為56 CFU/mL。

2.3 RF-LAMP檢測人工污染肉制品的檢出限

實(shí)時(shí)熒光LAMP法人工污染肉制品檢出限的確定見圖2。

從圖2中可以看出，當(dāng)沙門氏菌純培養(yǎng)物濃度為5.6×107CFU/g～5.6×104CFU/g時(shí)，熒光曲線出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增峰，儀器自動(dòng)判定為陽性；當(dāng)培養(yǎng)物濃度為5.6×103CFU/g時(shí)，熒光曲線平緩，未出現(xiàn)擴(kuò)增峰，判定為陰性。因此，研究所建立RF-LAMP檢測人工污染肉制品的檢出限為5.6×104CFU/g。

圖2 實(shí)時(shí)熒光LAMP法人工污染肉制品檢出限的確定

3 結(jié)論

研究建立了一種RF-LAMP方法來快速檢測沙門氏菌，檢測靈敏度為56 CFU/mL，檢測人工污染肉制品中沙門氏菌的檢出限為5.6×104CFU/g。該方法是在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，向體系中添加熒光染料，通過觀察是否有峰圖出現(xiàn)就可知道反應(yīng)是否發(fā)生。與PCR方法相比，RF-LAMP可在等溫條件下完成擴(kuò)增，不需要昂貴的PCR儀；與傳統(tǒng)LAMP相比，該方法的靈敏度更高，且避免了傳統(tǒng)LAMP產(chǎn)生的氣溶膠污染。該方法在結(jié)果出現(xiàn)后可直接終止反應(yīng)，既節(jié)省時(shí)間又降低了試驗(yàn)成本，同時(shí)避免了繁瑣的電泳。總之，該研究建立的RF-LAMP檢測沙門氏菌方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，為沙門氏菌的快速檢測開辟了新途徑，適合在基層檢測機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。