袁 婷，陳薇薇，孫海艷，楊慧萍，梁國魯*，郭啟高*

（西南大學園藝園林學院，南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶 400716）

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）為薔薇科（Rosaceae）枇杷屬常綠喬木[1]，除在我國廣泛種植外，近些年在日本、巴基斯坦、印度、巴西、智利和以色列等30多個國家都有栽培[2-3]，枇杷果實酸甜可口、柔軟多汁、風味獨特，營養(yǎng)十分豐富[4]。果實揮發(fā)性成分能客觀反映不同水果的風味特點和果實成熟的程度，是評價果實品質的重要指標[5]。相對于蘋果、桃子、草莓、葡萄等果實[6-7]，現(xiàn)階段對枇杷揮發(fā)性物質的研究較少，國內外相關研究也多集中在對枇杷花[8]、枇杷酒[9]及其他枇杷加工產品揮發(fā)性成分等[10-11]方面，枇杷果實揮發(fā)性成分的相關報道最早開始于1982年[12]。枇杷果實根據果肉顏色可分為紅肉枇杷和白肉枇杷2 種類型[13]，不同果肉類型的果實所含有的揮發(fā)性物質種類和含量不同，風味品質會出現(xiàn)很大差異。目前枇杷果實揮發(fā)性成分的研究主要涉及品種間揮發(fā)性成分比較方面。Besada等[2]報道了‘Algerie’和‘Golden Nuggett’2 種枇杷果實發(fā)育過程中揮發(fā)性物質的變化；Besada等[14]結合代謝組學相關網絡分析對來自‘Aglerie’的3 個新品種‘Xirlero’、‘Amadeo’和‘Raúl’枇杷果實揮發(fā)性物質進行分析；蔣際謀等[15]對‘香甜’和‘解放鐘’及兩者雜交子代優(yōu)系果實揮發(fā)性成分進行研究。對不同果肉類型枇杷果實風味品質起主要作用的揮發(fā)性成分及其含量方面的研究還比較有限[16-17]。

本研究采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜聯(lián)用技術，通過對7 個白肉品種和15 個紅肉品種枇杷成熟果肉的揮發(fā)性成分的測定，分別根據各類揮發(fā)性化合物和主要揮發(fā)性物質進行聚類分析和主成分分析，進一步闡述不同果肉類型枇杷揮發(fā)性成分差異，以期為枇杷揮發(fā)性成分的研究、根據揮發(fā)性物質討論品種親緣關系及不同果肉類型枇杷在生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以西南大學果樹學重點實驗室枇杷種質資源圃的22 個品種[18]枇杷（表1）為材料，選取大小均勻、無病蟲害的商品成熟期果實，每個品種采摘90～100 個，低溫運至實驗室，去除有機械損傷的果實，每30 個果實作為1 個重復，每個樣品重復3 次。其中，20 個果實用于測定單果質量、果實大小、可溶性固形物和可滴定酸等基本指標，其余10 個果實快速分離其果皮和果肉，取果肉用液氮快速冷凍，并在－80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試枇杷品種Table 1 Loquat accessions used in this study

1.2 儀器與設備

2010-Plus氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、AOC-500自動進樣裝置 日本島津公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯萃取頭 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取條件

萃取裝置：AOC-5000自動進樣；萃取溫度40 ℃，萃取時間20 min；樣品量5 g加入5 mL飽和氯化鈉混勻，前平衡30 min，解吸附5 min。

1.3.2 色譜條件

Rtx-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫

程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速率升至150 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃，保持1 min，最后以5 ℃/min的速率升至240 ℃保持2 min；載氣（He）流速1 mL/min，恒線速率，不分流進樣。

1.3.3 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z 35～350。

1.4 數(shù)據處理

揮發(fā)性物質數(shù)據分析運用計算機檢索并與圖譜庫（NIST 08）的標準質譜圖對照，選匹配度大于85%的檢測結果。計算各個化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）[20]并結合相關文獻進行定性分析[2,8,14-15,19-20]，根據峰面積歸一化法算出樣品各個組分的相對含量，所有樣品均設3 個重復，測定結果以 ±s表示。針對實驗所用22 個枇杷品種鑒定的主要揮發(fā)性成分，進行主成分分析，用ward法進行聚類分析。所有數(shù)據采用SPSS 19.0、JAM 13.0軟件處理。RI按下式計算：

式中：RTunknow為待測組分的保留時間/min；RTn、RTn+1為待測組分前后正構烷烴的保留時間/min；n為正構烷烴的碳原子數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不同品種枇杷理化指標

表2 枇杷果實理化指標（n=3）Table 2 Physicochemical characteristics of loquat fruit from different varieties(n= 3)

如表2所示，單果質量的平均值最大是‘大五星’，為49.33 g，最小的是‘森尾早生’，為14.46 g；可溶性固形物質量分數(shù)最高的是‘早鐘6號’，為16.53%，最低的是‘大五星’，為9.27%；‘常白1號’的總酸質量濃度最大，為0.84 g/L，最小的是‘香鐘’，為0.18 g/L；還原糖和轉化糖質量濃度最高的品種分別為‘常綠4號’和‘湖南早熟’，最低的分別為‘80-1’、‘大五星’。就整體趨勢而言，白肉枇杷各項理化指標平均值大于紅肉枇杷。

2.2 不同果肉類型枇杷揮發(fā)性物質

如表3所示，7 個白肉品種枇杷共鑒定出65 種揮發(fā)性成分，其中醛類20 種、萜烯類8 種、醇類12 種、酮類7 種、酯類9 種、其他9 種。不同品種所含揮發(fā)性物質有所差異，‘寧海白’檢測出的揮發(fā)性物質最多（41 種），最少為‘白玉’（30 種），揮發(fā)性物質總相對含量最高的是‘冠玉’（73.83%）、最低的是‘寧海白’（52.68%）。7 個白肉品種枇杷中醛類、醇類、酯類揮發(fā)性化合物平均相對含量較高，依次為44.02%、5.52%、2.85%，其次為酮類（1.91%）、萜烯類（1.81%）物質，正己醛是相對含量最高的物質，其次為反-2-己烯醛、壬醛。由此可見，醛類化合物是白肉枇杷果肉的主要揮發(fā)性成分，醇類、酯類、萜烯類、酮類揮發(fā)性物質構成不同品種白肉枇杷間的特異性風味。7 個白肉品種枇杷共同具有的揮發(fā)性物質為正己醛、反-2-己烯醛、正庚醛、正辛醛、壬醛、反-2-壬烯醛、癸醛、2-十一烯醛、正辛醇、1-壬醇、香葉基丙酮、莰酮、萘、對傘花烴，只在白肉枇杷中存在的揮發(fā)性物質為莰烯、氧化石竹烯、2-甲基丁酸，莰烯、氧化石竹烯分別只存在于‘白玉’、‘冠玉’中且相對含量較低（≤0.2%），2-甲基丁酸只在‘烏躬白’中檢測到，相對含量為2.30%。

如表4所示，15 個紅肉品種枇杷鑒定出81 種揮發(fā)性成分。醛類24 種、萜烯類8 種、醇類16 種、酮類8 種、酯類15 種、其他10 種。15 個紅肉品種枇杷的總芳香含量及各類揮發(fā)性化合物均表現(xiàn)出顯著差異，‘香鐘’揮發(fā)性物質總相對含量最高（79.05%），最低為‘單優(yōu)3號’（31.79%）；醛類（38.74%）是平均相對含量最高的一類揮發(fā)性化合物，其次是酯類（5.13%）、醇類（2.23%）。15 個紅肉品種枇杷果肉共同含有的主要揮發(fā)性物質為正己醛、反-2-己烯醛、正庚醛、正辛醛、壬醛、癸醛、正辛醇、莰酮、萘、對傘花烴，除‘80-1’、‘單優(yōu)3號’、‘簡陽早熟’、‘早紅3號’ 4 個品種中反-2-己烯醛的相對含量高于正己醛，其余紅肉品種中正己醛均為相對含量最高的揮發(fā)性物質。甜瓜醛、反-2,4-癸二烯醛、反-β-羅勒烯、3-蒈烯、丁二醇、葉醇、十二醇、植酮、乙酸己酯、水楊酸甲酯、丁酸芳樟酯、香葉酸甲酯、乙酸橙花酯、肉桂酸乙酯、百里香酚、丁香油酚是紅肉品種枇杷特有的揮發(fā)性物質，其中十二醇、肉桂酸乙酯、百里香酚能在5 個及以上紅肉品種枇杷中檢測到，其余物質只能在少數(shù)品種中檢測到，如‘湖南早熟’中檢測到反-β-羅勒烯、水楊酸甲酯、乙酸橙花酯3 種其他21 個品種中沒有檢測出的揮發(fā)性物質，‘東湖早’中有2 種特有的揮發(fā)性物質分別為3-蒈烯、葉醇，這些揮發(fā)性物質相對含量均較?。ā?%）。

表3 7 個白肉枇杷品種揮發(fā)性化合物相對含量Table 3 Volatile components content in different white loquat varieties

表4 15 個紅肉枇杷品種揮發(fā)性化合物含量Table 4 Volatile components content in different red loquat varieties

續(xù)表4

不同果肉類型枇杷果肉揮發(fā)性物質的差異主要體現(xiàn)在醇類、酯類物質，醇類物質在白肉枇杷中的平均相對含量約為紅肉枇杷的3 倍，正己醇為相對含量最高的醇類物質，除‘烏躬白’外的白肉枇杷中均存在，紅肉枇杷中只有‘晚鐘518’、‘77-1’、‘森尾早生’、‘香鐘’、‘興寧1號’中含有，且相對含量低于白肉枇杷。紅肉枇杷的酯類物質平均相對含量約為白肉枇杷的3 倍，2-甲基丁酸甲酯是所測紅肉枇杷果肉揮發(fā)性物質中主要的酯類物質，在白肉枇杷中相對含量較低或不能檢測到，乙酸己酯、水楊酸甲酯、丁酸芳樟酯、香葉酸甲酯、乙酸橙花酯、肉桂酸乙酯只在紅肉枇杷中存在，不存在于白肉枇杷中。無論是白肉枇杷還是紅肉枇杷，醛類物質都是果肉揮發(fā)性的主要成分，不同品種枇杷果肉醛類物質的差別也是風味差異的主要因素之一。如圖1所示，白肉枇杷的醛類物質平均相對含量略高于紅肉枇杷，正己醛是相對含量最高的揮發(fā)性物質，白肉枇杷的正己醛平均相對含量更高，但β-環(huán)檸檬醛、2,4-庚二烯醛在紅肉枇杷中普遍存在且相對含量明顯較高，在多個白肉品種枇杷中無法檢測出。萜烯類揮發(fā)性物質的變異系數(shù)最大，即相對含量變幅最大（表5），D-檸檬烯在萜烯類物質中相對含量較大，紅肉枇杷中的相對含量普遍高于白肉枇杷，在品種間相對含量差異也較大，只有‘晚鐘518’（1.09%）、‘常綠4號’（6.54%）、‘大五星’（1.73%）、‘單優(yōu)1號’（8.00%）、‘東湖早’（1.67%）、‘湖南早熟’（2.79%）7 個品種中的相對含量相對較高（≥1%）。所測出的酮類物質中主要揮發(fā)性物質是3-辛酮、香葉基丙酮、β-紫羅酮，其中香葉基丙酮、β-紫羅酮為脫輔基類胡蘿卜素類香氣物質，是類胡蘿卜素在裂解氧化酶作用下產生的具有揮發(fā)性的芳香味物質[21]，為目前公認的果實揮發(fā)性物質的重要組分[22]，除‘冠玉’、‘烏躬白’ 2 個品種外，白肉枇杷脫輔基類胡蘿卜素揮發(fā)性成分的相對含量遠低于紅肉枇杷。

圖1 不同果肉顏色枇杷各類揮發(fā)性物質比較Fig. 1 Comparison of the volatiles of loquat cultivars with different flesh colors

表5 枇杷中各類揮發(fā)性成分相對含量Table 5 Relative contents of volatile components in different varieties of loquat

2.3 枇杷品種揮發(fā)性物質聚類分析

22 個枇杷品種檢測出的揮發(fā)性物質可分為醛類、酯類、萜烯類、醇類、酮類、其他6 類，將各類揮發(fā)性化合物數(shù)據用JAM13.0統(tǒng)計軟件進行系統(tǒng)聚類，如圖2所示。當把22 個枇杷品種分為4 類時，第1類為除‘冠玉’、‘烏躬白’外的白肉品種和紅肉品種‘東湖早’、‘晚鐘518’、‘77-1’、‘興寧1號’；第2類包括‘冠玉’、‘森尾早生’、‘香鐘’、‘烏躬白’、‘早紅3號’、‘早鐘6號’；第3類主要包括‘80-1’、‘簡陽早熟’和‘單優(yōu)’系列；‘大五星’、‘湖南早熟’為第4類。聚類分析不能把白肉枇杷和紅肉枇杷完整分開，但在第1類中‘白玉’、‘常綠4號’、‘貴妃’3 個白肉枇杷能完全聚集在一起，且‘常白’、‘寧海白’與它們間距較小，可推測對于部分品種枇杷果肉揮發(fā)性物質來說，果肉顏色差異較品種差異影響更為明顯。

圖2 枇杷果肉各類揮發(fā)性物質聚類分析Fig. 2 HCA analysis based on volatile components in different varieties of loquat

2.4 枇杷品種揮發(fā)性物質的主成分分析

主成分分析法將多個變量通過線性變換選出較少幾個重要變量[23]，利用JAM 13.0軟件對22 個品種枇杷果實普遍存在且相對含量相對較高（≥1%）的18 種主要揮發(fā)性物質（正己醛、反-2-己烯醛、正庚醛、正辛醛、壬醛、反-2-壬烯醛、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、正辛醇、正己醇、2-甲基丁酸甲酯、乙酸丁酯、D-檸檬烯、香葉基丙酮、β-紫羅酮、3-辛酮、對傘花烴、鄰二甲苯）進行主成分分析，提取6 個主成分，累計貢獻率89.50%，能有效解釋變量的大部分信息。

第1主成分貢獻率較高為35.30%，載荷較高且正相關的揮發(fā)性物質為壬醛、正辛醛、3-辛酮、癸醛、正庚醛、反-2-壬烯醛、正辛醇，載荷量依次為0.944、0.935、0.907、0.867、0.828、0.822、0.749；第2主成分貢獻率為17.60%，正己醛、2-甲基丁酸甲酯、正己醇、反-2-已烯醛載荷量較高，分別為0.912、0.802、0.750、0.690，2-甲基丁酸甲酯為負相關；第3主成分貢獻率為14.59%，載荷量較高的是β-紫羅酮、β-環(huán)檸檬醛、對傘花烴，依次為0.825、0.802、0.699。由此可得出18 種揮發(fā)性物質中壬醛、正辛醛、3-辛酮、癸醛、正己醇、β-紫羅酮、β-環(huán)檸檬醛對枇杷果肉風味貢獻較大[24-26]。基于18 種揮發(fā)性物質的主成分分析模型中（圖3），供試品種可被明顯地區(qū)分為4 類。白肉枇杷除‘冠玉’、‘烏躬白’外的品種和‘興寧1號’、‘77-1’、‘湖南早熟’、‘大五星’ 4 個紅肉枇杷聚集在一類，‘單優(yōu)’系列和‘80-1’聚集在一起，‘烏躬白’與‘東湖早’、‘簡陽早熟’聚集，‘冠玉’和其余紅肉枇杷品種聚集。

圖3 不同品種枇杷果肉主要揮發(fā)性物質主成分分析Fig. 3 PCA analysis based on main volatile components in different varieties of loquat

3 結論與討論

陳秋燕等[27]對白肉枇杷和紅肉枇杷成熟果實的可溶性糖進行分析，發(fā)現(xiàn)白肉枇杷果實總糖含量顯著高于紅肉枇杷果實。本研究對7 個白肉品種枇杷和15 個紅肉品種枇杷成熟果實進行主要理化指標的測定，白肉枇杷單果質量、總酸、還原糖、轉化糖、可溶性固形物的平均值均大于紅肉枇杷，與前人[17,27]的研究結果一致。

Besada等[14]對‘Xirlero’、‘Amadeo’和‘Raúl’枇杷果實揮發(fā)性物質進行檢測，發(fā)現(xiàn)羧酸是主要揮發(fā)性成分。蔣際謀等[15]將枇杷品種‘香甜’和‘解放鐘’及兩者雜交子代優(yōu)系果實進行揮發(fā)性成分分析結果顯示，萜類物質相對含量最高（62.59%～68.32%），其次是醛類物質（12.53%～18.15%）。本研究結果表明：22 個品種枇杷果肉的主要揮發(fā)性成分為醛類物質，酯類、酮類和醇類是構成不同品種枇杷特有風味的重要組成，正己醛是相對含量最高的揮發(fā)性物質，與前人[14-15]的研究結果有所不同，這可能是枇杷品種及栽培地區(qū)不同造成的差異。不同果肉顏色果實揮發(fā)性化合物的主要差異為醇類和酯類物質，醇類物質在白肉枇杷中的平均相對含量約為紅肉枇杷的3 倍，但紅肉枇杷的酯類物質平均相對含量約為白肉枇杷的3 倍，使水果呈清香型氣味的揮發(fā)性物質主要是C6和C9的醛類及醇類[28]，酯類和內酯類物質為主要的果香型化合物[29]。因此，可初步推測白肉枇杷偏向清香型，紅肉枇杷果香味更濃、清香味淡。不同的揮發(fā)性物質在不同品種、不同果肉顏色枇杷中的相對含量有明顯差異。正己醇為相對含量最高的醇類物質，在白肉枇杷中普遍存在，紅肉枇杷中只有少量品種能檢測出且相對含量較低。果實風味的重要組分脫輔基類胡蘿卜素類香氣物質為香葉基丙酮、β-紫羅酮，在紅肉枇杷中的相對含量明顯高于白肉枇杷，其相對含量的高低可能與枇杷果肉色澤有關[30-31]。2-甲基丁酸、莰烯、氧化石竹烯、癸酸甲酯、反-β-羅勒烯、水楊酸甲酯、乙酸橙花酯、3-蒈烯、葉醇都僅能在一個品種枇杷中被檢測出，其中2-甲基丁酸相對含量最高（2.30%）。Besada等[2,14]進行‘Algerie’和‘Golden Nuggett’ 2 個品種枇杷果實揮發(fā)性檢測，也僅在‘Algerie’中檢測到2-甲基丁酸，進行來自‘Aglerie’的3 個新品種‘Xirlero’、‘Amadeo’和‘Raúl’果實揮發(fā)性成分比較時，3個品種都能檢測到2-甲基丁酸，這些揮發(fā)性物質的差異構成了品種之間的風味差異，是品種特異性揮發(fā)性物質。

通過主成分分析法和聚類分析法不能把白肉枇杷和紅肉枇杷徹底劃分開，但都能把除‘冠玉’、‘烏躬白’外的白肉枇杷相對聚集，說明對于部分品種枇杷果肉揮發(fā)性物質來說，果肉顏色差異較品種差異影響更為明顯，并且以不同品種主要揮發(fā)性物質進行主成分分析分類和用各類揮發(fā)性物質聚類分析結果相近，主成分分析更能把親緣關系相近的枇杷品種聚集在一起，如‘單優(yōu)’系列聚集，‘早鐘6號’和父本‘森尾早生’聚集[15]，進一步證明所選的18 種揮發(fā)性物質在枇杷果肉風味構成中十分重要，是主要的呈香物質，以期為根據揮發(fā)性物質討論枇杷品種親緣關系提供參考。Rodríguez等[32]已利用主成分分析模型進行萜烯揮發(fā)性物質對橙汁風味口感的影響研究，本研究也能通過主成分分析特征值、貢獻率和載荷矩陣對枇杷果肉單個揮發(fā)性物質品質進行評價，鑒定出對枇杷果肉風味貢獻率較高的揮發(fā)性物質是壬醛。