鄧曉影，張 賓*，湯 賀，郝桂娟，章樣揚(yáng)

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316022）

南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）學(xué)名凡納濱對蝦，是世界對蝦養(yǎng)殖中產(chǎn)量較高的三大優(yōu)良蝦種之一，同時也是目前養(yǎng)殖對蝦中單產(chǎn)量最高的蝦種[1]。南美白對蝦作為一種高度易腐水產(chǎn)品，蝦體死亡后，污染微生物及其代謝物和體內(nèi)內(nèi)源酶均可加速蝦體品質(zhì)劣變及腐敗進(jìn)程，因此南美白對蝦捕后極不耐貯藏、商品貨架期相對較短。南美白對蝦受生長環(huán)境、加工工藝及貯藏過程的影響，蝦體表面附著的微生物通常數(shù)量較多，且種類組成也十分復(fù)雜[2-4]。這些微生物不僅影響著南美白對蝦及其制品的食用安全，而且對南美白對蝦貯藏期間的品質(zhì)保障起到主要作用[5]。

近年來發(fā)展起來的宏基因組學(xué)技術(shù)避開了傳統(tǒng)微生物的分離培養(yǎng)方法，而直接從測試樣品中提取總DNA進(jìn)行分析，能更完整地反映樣品中微生物的群落特征。目前，高通量測序技術(shù)已成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的常用技術(shù)，其實(shí)現(xiàn)了同時對幾百萬DNA分子的測序，達(dá)到了鑒定微生物單一基因或全基因組的目的。高通量測序主要有454焦磷酸測序平臺（Roche公司）、HiSeq和MiSeq測序平臺（Illumina公司）以及Solid測序平臺（ABI公司）。近年來，隨著現(xiàn)代測序技術(shù)快速發(fā)展，研究者已將高通量測序技術(shù)成功應(yīng)用于多個學(xué)科領(lǐng)域，如土壤多樣化，海洋和腸道環(huán)境、發(fā)酵食品、人類健康與疾病等方面[6-7]。目前，關(guān)于蝦類中微生物菌群研究，絕大部分集中于養(yǎng)殖水體微生物多樣性、蝦腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及冷凍蝦類產(chǎn)品中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)等，而關(guān)于對蝦在不同鮮度及加工過程中的菌群變化情況還鮮見報道[8]。本實(shí)驗(yàn)以不同狀態(tài)下的南美白對蝦為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析對蝦樣品中的菌群組成情況，為南美白對蝦制品的品質(zhì)保障與質(zhì)量安全提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

活南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）（體長14～16 cm），2017年購自浙江舟山市東河水產(chǎn)品市場，將活蝦置于呈有養(yǎng)殖水體的暫存箱內(nèi)，15～20 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

TransStart FastPfu DNA Polymerase 美國Qiagen公司；TruSeqTMDNA Sample Prep Kit等測序用試劑 美國Illumina公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen Biosciences公司。

GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerize chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與預(yù)處理

將南美白對蝦分為以下處理組：活體對蝦（帶殼整蝦）、冰鮮對蝦（4 ℃條件下死亡3～5 h后的鮮蝦）、冰鮮蝦仁（實(shí)驗(yàn)室條件下，將死亡鮮蝦去頭殼，不去蝦腸，獲得蝦仁）和冷凍蝦仁（冰鮮蝦仁密封于無菌袋中，－18 ℃凍藏4 周后的蝦仁）。

1.2.2 蝦體表面微生物提取[9]

將以上各組蝦類樣品，在無菌三角瓶中加入9 倍體積的無菌生理鹽水后，室溫條件下在培養(yǎng)搖床中以300 r/min提取60 min，將蝦體表面微生物提取到無水生理鹽水中。采用紗布過濾、無菌水淋洗后，濾液以12 000 r/min離心15 min，將離心獲得菌體沉淀物進(jìn)行微生物菌落分析。

1.2.3 蝦體表面微生物群落分析

首先采用基因組DNA提取試劑盒（按產(chǎn)品說明書進(jìn)行）對蝦體表面微生物進(jìn)行基因組DNA抽提，進(jìn)而利用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測抽提的基因組DNA；按指定測序區(qū)域，合成帶有條碼特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對16S rRNA基因V3/V4區(qū)合成特異引物，利用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，而后進(jìn)行Illumina MiSeq 2×300 bp高通量測序及生物信息學(xué)分析。

1.2.4 蝦體表面微生物信息分析

對MiSeq測序得到的PE reads，首先依據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度進(jìn)行檢測?；诜诸悓W(xué)信息，在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)[10]。在上述分析基礎(chǔ)上，最后進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析（具體由微基生物科技（上海）有限公司協(xié)助完成）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Illumina高通量測序獲得不同對蝦樣本原始序列數(shù)據(jù)后，采用Trimmomatic軟件進(jìn)行序列質(zhì)控，F(xiàn)lash軟件進(jìn)行序列拼接，再經(jīng)序列優(yōu)化及統(tǒng)計(jì)后得到各實(shí)驗(yàn)組有效序列范圍為30 591～42 043條，其平均長度范圍為444.73～449.87 bp。其中，有效序列長度范圍在441～460 bp之間的序列，占有效序列總數(shù)的95.61%。進(jìn)而對樣品序列進(jìn)行聚類分析，在97%相似水平下的OTU生物信息統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，各處理組得到的OTU數(shù)量范圍為68～168，其中冷凍蝦仁OTU數(shù)量最低為68，而活體對蝦和冰鮮對蝦OTU數(shù)量較高，分別為153和168（表1）。由以上聚類結(jié)果可知，活體對蝦和冰鮮對蝦中特有微生物相對種類較多，而冷凍后蝦仁中微生物種類明顯減少，其原因一方面來自于蝦殼及頭部的去除減少了部分微生物，更重要的是低溫冷凍對部分微生物也產(chǎn)生了較強(qiáng)的抑制或殺滅作用[11-13]。

表1 各組樣品有效序列與OTU數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Numbers of valid sequences and OTUs in different shrimp samples

2.2 多樣性指數(shù)分析

可通過單樣本多樣性（Alpha多樣性）分析反映微生物群落的豐度和多樣性。各樣本文庫覆蓋率的數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低，直接反映測序結(jié)果是否代表樣本中微生物的真實(shí)情況[14-15]。由表2可知，所有樣本測序覆蓋率均在0.998以上，說明測序?qū)颖局屑?xì)菌的覆蓋率很高，測序深度適合，可滿足樣品中細(xì)菌多樣性分析的需要[16]。此外，當(dāng)樣品測序數(shù)量超過20 000時，各樣品稀釋曲線均趨向飽和（圖1A），表明樣品測序數(shù)據(jù)量合理，更多數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新OTU[17]。同時，Shannon-Wiener曲線趨也逐漸向平坦（圖1B），說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。上述現(xiàn)象表明，隨著測序量增加新的菌系不會被發(fā)現(xiàn)，微生物多樣性也不會發(fā)生顯著變化，菌群分析結(jié)果合理、充分。

圖1 稀釋曲線（A）和Shannon-Wiener曲線（B）分析Fig. 1 Rarefaction curves (A) and Shannon-Wiener curves (B)

樣品菌群豐度的表征主要有ACE和Chao1指數(shù)，而菌群多樣性的表征主要有Shannon和Simpson指數(shù)[18]。相比于活體對蝦，死亡后冰鮮對蝦樣品的ACE、Chao1和Shannon指數(shù)值升高、Simpson指數(shù)降低（表2），表明蝦體死亡及冰鮮貯藏過程中微生物污染及繁殖不斷加劇，該階段也是蝦體微生物種類及豐度顯著增加的階段。對于冰鮮蝦仁樣品，其ACE、Chao1和Shannon指數(shù)均低于活蝦和冰鮮蝦樣品，即去頭、殼過程可一定程度上降低蝦仁中微生物的多樣性，但需要指出的是由于實(shí)際加工過程往往為非無菌操作，也致使蝦仁中殘留相當(dāng)數(shù)量的微生物甚至有污染致病微生物的可能。相比于其他各組，冷凍蝦仁樣品的ACE、Chao1和Shannon指數(shù)最低，Simpson指數(shù)最高，表明其菌群豐度及多樣性較低，其原因可能由于低溫作用抑制了部分微生物的生長與繁殖，致使蝦仁中微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性變化。

表2 各組樣品的多樣性指數(shù)分析Table 2 Bacterial community diversity of different shrimp samples

2.3 不同分類水平上的物種注釋及分析

為獲得每個OTU對應(yīng)物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在科（圖2）和屬（圖3）水平上統(tǒng)計(jì)各樣本群落組成。

圖2 不同對蝦樣品微生物物種組成（科水平）Fig. 2 Bacterial community composition at family level in different groups of shrimp

在科分類水平上（圖2），活體對蝦表面主要微生物為黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、假交替單胞菌科（Pseudoalteromonadaceae）和海洋螺菌科（Oceanospirillaceae），以上3 個菌科微生物占菌群總量的73.91%。冰鮮對蝦中主要微生物為黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、紅曲菌科（Rhodobacteraceae）、希瓦氏菌科（Shewanellaceae）以及假交替單胞菌科（Pseudoalteromonadaceae），占菌群總量的80.97%。相比于活蝦，莫拉氏菌科相對豐度變化顯著，由活蝦中的0.48%升到21.39%。蝦體死亡、貯藏時間不斷延長，其微生物種類及數(shù)量增加、內(nèi)源酶活性突顯，蝦仁品質(zhì)逐漸下降。冰鮮對蝦中莫拉氏菌科含量增加，可能與蝦體死亡、微生物污染繁殖有關(guān)。曹榮等[19]研究牡蠣冷藏過程中菌落分析發(fā)現(xiàn)，冷藏4 d后牡蠣附著的莫拉氏菌科豐度也顯著增加。冰鮮蝦仁中主要為弧菌科（Vibrionaceae）、希瓦氏菌科（Shewanellaceae）、假交替單胞菌科（Pseudoalteromonadaceae）以及莫拉氏菌科（Moraxellaceae），占菌群總量的88.33%。其中，弧菌科豐度最高（55.96%）、希瓦氏菌科次之（17.1%）。相比于冰鮮對蝦，二者豐度值顯著增加，成為冰鮮蝦仁表面的優(yōu)勢微生物，其來源可能是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的微生物，以及蝦仁制備過程中由加工器具等轉(zhuǎn)移污染的微生物。此外，黃桿菌科（Flavobacteriaceae）和莫拉氏菌科（Moraxellaceae）的豐度明顯減少，表明該兩種菌科微生物可能較多的分布于蝦殼表面，因此在蝦仁剝殼及去頭過程中豐度顯著降低。冷凍蝦仁中莫拉氏菌科（Moraxellaceae）為優(yōu)勢菌種，豐度占總菌群59.02%，其次為假單胞菌科（Pseudomonadaceae）（26.50%）、李斯特菌科（Listeriaceae）（6.30%）。研究表明，莫拉氏菌科（Moraxellaceae）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae）為典型嗜冷菌，其為冷凍肉制品、冷凍水產(chǎn)品等的腐敗微生物，且李斯特菌科對酸堿度適應(yīng)范圍廣，其在生冰箱冷藏溫度、低酸及高鹽環(huán)境中仍可生長[20]。此外，和冰鮮蝦仁相比，冷凍蝦仁中弧菌科和希瓦氏菌科明顯減少，主要與微生物自身低溫耐受性有關(guān)，二者會隨著凍藏溫度的降低及凍藏時間的延長而逐漸減少。

在屬分類水平上（圖3），活體對蝦中主要微生物為黃桿菌屬（Flavobacterium）、假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）和油螺旋菌屬（Oleispira）。冰鮮對蝦中主要微生物為黃桿菌屬（Flavobacterium）、嗜冷菌屬（Psychrobacter）、希瓦氏菌（Shewanella）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）。孫振麗等[21]研究發(fā)現(xiàn)，活體對蝦的腸道中主要優(yōu)勢細(xì)菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）等，該研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果較為相似，也表明對蝦表面與其腸道內(nèi)細(xì)菌組成較為相近。相比于活體對蝦，冰鮮對蝦中嗜冷菌屬（Psychrobacter）顯著增加。鄭振霄等[22]研究發(fā)現(xiàn)，冰鮮鮐魚（－1～0 ℃）中微生物組成比較復(fù)雜，其優(yōu)勢種群為嗜冷菌屬（Psychrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonadaceae），且隨著貯藏時間延長，鮐魚樣品中菌相逐漸變的單一。冰鮮蝦仁中優(yōu)勢菌群為弧菌屬（Vibrio），其豐度占總菌群的54.20%，次優(yōu)勢菌群為希瓦氏菌（Shewanella）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），分別占總菌群的17.10%和9.86%?；【鷮伲╒ibrio）包含有80多種，其中為病原菌，如霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌等[23-24]。由以上結(jié)果可知，蝦仁制備過程中，為弧菌屬污染主要階段，其可能對蝦類制品質(zhì)量安全造成隱患。冷凍蝦仁附著優(yōu)勢微生物主要為嗜冷菌屬（Psychrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix），因此對于冷凍蝦仁品質(zhì)的調(diào)控，應(yīng)重點(diǎn)針對以上幾種菌屬進(jìn)行。低溫貯藏環(huán)境雖可減少蝦仁中微生物種類，但仍存在以上幾種典型嗜冷微生物菌屬，因此針對冷凍蝦仁類產(chǎn)品，需對以上幾種菌屬進(jìn)行重點(diǎn)調(diào)控。

2.4 菌群樣本組成分析

熱圖顏色變化反映二維矩陣或表格中數(shù)據(jù)信息，可直觀地將數(shù)據(jù)值大小以定義顏色深淺表示出來[25-27]。在熱圖上，將高豐度和低豐度物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度反映多個樣本群落組成相似性和差異性[28]。從物種和樣本兩個層面對OTU進(jìn)行聚類，繪制物種豐度熱圖，結(jié)果如圖4所示。由樣本間菌群結(jié)構(gòu)相似度（圖4，上方進(jìn)化樹）分析發(fā)現(xiàn)，活體對蝦和冰鮮對蝦聚為一類，而冰鮮蝦仁、冷凍蝦仁各自單獨(dú)聚為一類。由此，活體對蝦和冰鮮對蝦菌群結(jié)構(gòu)整體相似度較高，其與冰鮮蝦仁、冷凍蝦仁相似度較差，表明蝦仁制備過程、低溫凍藏對于蝦仁中菌群結(jié)構(gòu)影響較大。該結(jié)果與以上物種分析結(jié)果相一致。

對于菌門豐度聚類分析發(fā)現(xiàn)，無論是活體、還是冰鮮對蝦樣品，在微生物組成中比例較大的均為黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、假交替單胞菌科（Pseudoalteromonadaceae）。在活體對蝦-死亡（冰鮮）對蝦-冰鮮蝦仁-冷凍蝦仁加工及貯藏過程中，以伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、李斯特菌科（Listeriaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）及腸球菌科（Enterococcaceae）等為代表的菌科含量，在冷凍蝦仁中明顯增加，這可能是因?yàn)橐陨蠋追N菌科環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，在冷藏過程中菌群數(shù)量逐漸增加，成為南美白對蝦冷藏中的優(yōu)勢菌群。而以黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、NS9_marine group、蟑螂桿狀體科（Cryomorphaceae）、弧菌科（Vibrionaceae）、著色菌科（Chromatiaceae）、腐螺旋菌科（Saprospiraceae）等為代表的菌科含量明顯減少，其原因主要是以上幾種菌科主要附著在蝦體表面及大部分不耐低溫特性而造成。不同對蝦樣品在域、門、綱、目、科等分類學(xué)水平上的物種比例和分布，如圖5所示?？傮w來看，對蝦樣品處于不同狀態(tài)下，其優(yōu)勢微生物、菌群結(jié)構(gòu)、相對豐度及相互比例，均發(fā)生了顯著性變化，因此，針對于不同類型的蝦類產(chǎn)品，需采取不同的控制條件及工藝技術(shù)，以保障蝦類產(chǎn)品的質(zhì)量與安全。

圖4 不同對蝦樣品微生物豐度聚類熱圖（科水平）Fig. 4 Microbial community heatmap analysis at phylum level for different groups of shrimp

圖5 不同對蝦樣品在域、門、綱、目、科等分類學(xué)水平上的物種比例和分布Fig. 5 Composition and distribution patterns of microbiota in different groups of shrimp at phylum, class, order, and family levels

2.5 樣本主成分分析（principal component analysis，PCA）比較

圖6 不同對蝦樣品PCAFig. 6 PCA plots for different groups of shrimp

PCA可將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構(gòu)[29]。通過分析不同樣本OTU（97%相似性）組成，可以反映樣本間的差異和距離，PCA運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，如樣本組成越相似，反映在PCA圖中相應(yīng)坐標(biāo)軸上的距離越近[30-33]。南美白對蝦樣本PCA結(jié)果，如圖6所示。對于PC1、PC2，活體對蝦和冰鮮對蝦樣本較為相近，說明在這一主成分水平上活蝦和剛死亡的冰鮮蝦的菌群特征較為相近。對于PC1～3分析，對于活體對蝦、冰鮮對蝦、冰鮮蝦仁和冷凍蝦仁4 組樣本，PC1和PC3方面均距離相對較遠(yuǎn)，以上4 種樣品在幾種特定微生物組成上存在著較大的差異。對于PC2、PC3分析中，在PC2上，冰鮮對蝦和冷凍蝦仁區(qū)分度明顯，說明蝦仁的去殼制備過程對其附著微生物組成具有較大影響，該結(jié)果與物種注釋分析結(jié)果一致。總體來看，在各個主成分坐標(biāo)軸上，冷凍蝦仁與其他組別樣本均相距較遠(yuǎn)，說明冷凍蝦仁中微生物種類及組成與其他樣品具有較大的差異。

3 結(jié) 論

以不同狀態(tài)下南美白對蝦為研究對象，采用Illumina高通量測序技術(shù)分析各樣品中菌群組成及變化情況。結(jié)果表明，活體對蝦、冰鮮對蝦、冰鮮蝦仁以及冷凍蝦仁中菌群組成差異較大，其中活體對蝦中主要為黃桿菌科、假交替單胞菌科及海洋螺菌科；冰鮮對蝦中主要為黃桿菌科、莫拉氏菌科、紅曲菌科、希瓦氏菌科及假交替單胞菌科；冰鮮蝦仁中主要為弧菌科、希瓦氏菌科、假交替單胞菌科及莫拉氏菌科；而冷凍蝦仁中微生物主要為莫拉氏菌科、假單胞菌及李斯特菌科。需要注意的是，冰鮮蝦仁中優(yōu)勢菌為弧菌科，冷凍蝦仁中以莫拉氏菌科、假單胞菌科及李斯特菌科為優(yōu)勢菌科。這幾個菌科對于南美白對蝦質(zhì)量安全與品質(zhì)保障具有重要影響作用，在加工及貯藏過程中應(yīng)加以重點(diǎn)關(guān)注。