趙 丹，杜仁鵬，宋 剛，孫 健，平文祥，葛菁萍,*

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500）

酸菜是酸漬大白菜的簡(jiǎn)稱，指在低濃度食鹽條件下，經(jīng)過(guò)乳酸發(fā)酵而形成的蔬菜發(fā)酵制品，是我國(guó)東北地區(qū)特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品的典型代表之一[1-2]。酸菜腌制時(shí)，原材料不需要滅菌，微生物種群和化學(xué)組分多樣，生物因素與非生物因素內(nèi)部及之間的相互作用十分復(fù)雜[3-4]。酸菜發(fā)酵體系是一種微生態(tài)系統(tǒng)，其中含有乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）、酵母菌、霉菌等多種微生物[5-6]。隨著人們對(duì)酸菜的關(guān)注和酸菜工業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)酸菜的微生物菌群進(jìn)行研究，證實(shí)LAB是酸菜發(fā)酵系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌種[7-8]。20世紀(jì)30年代，Pederson[9]研究了蔬菜發(fā)酵過(guò)程中微生物，第一次指出了Leuconostoc mesenteroides啟動(dòng)蔬菜發(fā)酵。張魯冀等[10]利用生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA測(cè)序鑒定法從東北自然酸菜發(fā)酵液中分離得到Lactobacillus brevis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri。張先琴[11]對(duì)四川自然泡菜發(fā)酵過(guò)程中的菌體多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus是泡菜發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群，且發(fā)酵的過(guò)程中存在Pediococcus、Lactococcus以及Aspergillus、Candida albicans等，但真菌的菌群密度較低。

近年來(lái)，益生菌LAB在發(fā)酵食品中的過(guò)程和功能研究日益引人關(guān)注。尤其是LAB作為發(fā)酵劑參與發(fā)酵食品生產(chǎn)過(guò)程，如乳制品、豆制品、飲料和腌漬食品等[12]。LAB代謝物特征與發(fā)酵食品的口味、香味、結(jié)構(gòu)、顏色以及菌群分布密切相關(guān)[13]。不同發(fā)酵階段，發(fā)酵系統(tǒng)中菌群發(fā)生演替，其中以LAB作為發(fā)酵劑加入酸菜當(dāng)中，不僅可以顯著縮短發(fā)酵周期，而且能夠降低發(fā)酵系統(tǒng)的菌群多樣性，從而為酸菜的風(fēng)味、品質(zhì)提供更高的保障[14-15]。Jung等[16]采用核磁共振氫譜結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，研究L. mesenteroides作為發(fā)酵劑，對(duì)韓國(guó)泡菜發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群和代謝物組的影響，結(jié)果表明，Weissella和Lactobacillus是發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬，主要風(fēng)味物質(zhì)是單糖類的葡萄糖和果糖，有機(jī)酸類的乳酸和乙酸。然而很多研究者認(rèn)為，接種LAB（如：L. plantarum、L. mesenteroides等）發(fā)酵酸菜具有發(fā)酵時(shí)間短、受季節(jié)影響小、品質(zhì)易于控制的特點(diǎn)，但風(fēng)味不如自然發(fā)酵的酸菜自然、醇厚[17]。采用接入發(fā)酵劑的方式進(jìn)行發(fā)酵，使其風(fēng)味逐步接近自然酸菜是大規(guī)模生產(chǎn)需要不斷努力的目標(biāo)。

課題組前期著重研究自然酸菜發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)中的菌群演替情況，并對(duì)菌體進(jìn)行分離鑒定[18]。本研究以此作為基礎(chǔ)，以分離自自然酸菜發(fā)酵液中高產(chǎn)乳酸的L. casei 11MZ-5-1為發(fā)酵劑[19]，構(gòu)建酸菜發(fā)酵微生物生態(tài)系統(tǒng)研究模型，對(duì)比分析L. casei 11MZ-5-1酸菜發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸、總酸、亞硝酸鹽、VC、甘油、乙醇、甘露醇、2,3-丁二醇等關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及細(xì)菌多樣性的差異。研究結(jié)果有助于酸菜工藝的監(jiān)控和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，對(duì)加菌酸菜質(zhì)量穩(wěn)定性的提高和產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平的提升具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及材料

L. casei 11MZ-5-1保藏于黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

中國(guó)大白菜 哈爾濱哈達(dá)蔬菜批發(fā)市場(chǎng)；食用鹽中國(guó)鹽業(yè)總公司；180 L自制發(fā)酵罐由課題組自行設(shè)計(jì)研制。

1.1.2 試劑盒

M2023細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、L9014瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、M1603質(zhì)粒小提試劑盒 天根生化科技有限公司；S004細(xì)菌微量生化鑒定管、S022嗜熱鏈球菌生化鑒定套裝、S021乳酸桿菌生化鑒定套裝、S001腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管 北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸銨2 g，CH3COONa·3H2O 5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。用于LAB的分離與培養(yǎng)。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，108 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。用于酵母菌和霉菌的分離與培養(yǎng)。

LB培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，pH 7.0～7.2，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。用于Enterobacteria的分離與培養(yǎng)。

KAA培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0 g，牛肉膏3.0 g，酵母浸膏5.0 g，牛膽粉10.0 g，氯化鈉5.0 g，檸檬酸鈉1.0 g，七葉苷1.0 g，檸檬酸鐵銨0.5 g，疊氮化鈉0.25 g，瓊脂13.5 g，1 000 mL蒸餾水，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。用于Enterococcus的分離與培養(yǎng)。

VRBA培養(yǎng)基：乳糖10 g，酵母浸粉3 g，中性紅0.03 g，結(jié)晶紫0.002 g，蛋白胨7 g，氯化鈉5 g，膽鹽1.5 g，瓊脂20 g，1 000 mL蒸餾水，煮沸2 min。用于Escherichia coli的分離與培養(yǎng)。

PCA培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。用于好氧細(xì)菌的分離與培養(yǎng)。

BP培養(yǎng)基：牛肉膏粉5 g，胰蛋白胨10 g，酵母膏粉1 g，丙酮酸鈉10 g，甘氨酸12 g，氯化鋰5 g，瓊脂15 g，pH 6.8～7.2，蒸餾水1000 mL。用于Staphyloccocus aureus的分離與培養(yǎng)。

BCS培養(yǎng)基：氯化鈉10.0 g，胰酪蛋白胨10.0 g，牛肉浸粉1.0 g，苯酚紅0.025 g，D-甘露醇10.0 g，瓊脂12.0 g，pH 6.8～7.2。用于Bacillus cereus的分離與培養(yǎng)。

SPS培養(yǎng)基：酵母浸粉10.0 g，胰酪蛋白胨15.0 g，亞硫酸鈉0.5 g，檸檬酸鐵0.5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.2。用于Clostridium的分離與培養(yǎng)。

FB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.9～7.1。用于Listeria monocytogenes的分離與培養(yǎng)。

PALCAM培養(yǎng)基：酵母浸粉3.0 g，D-葡萄糖0.5 g，氯化鋰15.0 g，蛋白胨23.0 g，可溶性淀粉1.0 g，D-甘露醇10.0 g，七葉苷0.8 g，檸檬酸鐵銨0.5 g，氯化鈉5.0 g，酚紅0.08 g，瓊脂13.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.4。用于Salmonella的分離與培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 酸菜發(fā)酵系統(tǒng)構(gòu)建

自然發(fā)酵酸菜系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱CK）：選取優(yōu)質(zhì)實(shí)心白菜，晾曬2 d后去除壞葉，用自來(lái)水清洗干凈，90 kg白菜逐層放置于發(fā)酵罐中壓實(shí)，加入1.35 kg食鹽，并用70 L水浸泡白菜，于15～20 ℃密封靜置發(fā)酵。L. casei 11MZ-5-1發(fā)酵酸菜系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱BA）：取90 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L. casei 11MZ-5-1作為發(fā)酵劑，接入到酸菜發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)。發(fā)酵時(shí)間為25 d，從第1天開(kāi)始按奇數(shù)天取樣，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 pH值及總酸的測(cè)定

用TOLEDO FE20型pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液pH值。參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[20]測(cè)定酸菜樣品中總酸的含量（以乳酸計(jì)）。

1.3.3 亞硝酸鹽及VC含量的測(cè)定

采用食品中亞硝酸鹽測(cè)試試劑盒測(cè)定酸菜發(fā)酵液中亞硝酸鹽的含量，具體實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。參照李軍[21]的方法測(cè)定酸菜發(fā)酵液中VC的含量。

1.3.4 風(fēng)味物質(zhì)含量的測(cè)定

甘露醇含量測(cè)定參照蔣華等[22]的方法；乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甘油、甘露醇、乙醇、2,3-丁二醇含量利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)。依照趙丹等[4]的方法，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測(cè)酯類、烷類、萜類、醛類、酮類、醚類、醇類、苯及衍生物類、萘及衍生物類、含硫化合物和雜環(huán)化合物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量。1.3.5 酸菜感官評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)10 名經(jīng)過(guò)感官品評(píng)培訓(xùn)的人員組成評(píng)定小組，依據(jù)韓德權(quán)等[23]的方法從色澤、香氣、口味、脆度及整體評(píng)價(jià)這5 項(xiàng)指標(biāo)對(duì)酸菜進(jìn)行品評(píng)。

1.3.6 BA酸菜中不同種屬細(xì)菌的分離純化與計(jì)數(shù)

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，取奇數(shù)天發(fā)酵液樣品10 mL，按10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋液分別涂布于MRS、YPD、VRBA、BP、KAA、PCA等平板上，每個(gè)稀釋度平行涂布3 個(gè)平板，在各自適宜的溫度下，培養(yǎng)24～48 h，分別檢測(cè)LAB、酵母菌、霉菌、好氧細(xì)菌、E. coli、Enterobacteria、Enterococcus、Staphyloccocus aureus、Bacillus cereus、Clostridium、Listeria monocytogenes、Salmonella，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。分析隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酸菜發(fā)酵系統(tǒng)中菌體的多樣性及演替情況。

1.3.7 BA酸菜發(fā)酵過(guò)程中菌體形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA鑒定

將培養(yǎng)基中分離得到的菌種，反復(fù)于新鮮的平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，直至得到單菌落。分別對(duì)這些純化的菌株進(jìn)行個(gè)體顯微形態(tài)（大小、形狀、革蘭氏染色）觀察和群體形態(tài)（菌落大小、直徑、光澤、形態(tài)、邊緣、中央突起情況等）觀察。將顯微結(jié)構(gòu)和菌體形態(tài)相似的菌株歸為一類。菌株生理生化實(shí)驗(yàn)采用試劑盒進(jìn)行鑒定，方法詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

取3 mL菌株發(fā)酵液，離心后收集菌體，用菌體基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，根據(jù)細(xì)菌的16S rDNA基因序列的保守區(qū)域，采用細(xì)菌通用引物（P1：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’；P2：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’），對(duì)分離純化菌株進(jìn)行16S rDNA部分序列的擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain raction，PCR）條件為95 ℃、2 min；94 ℃、60 s，56 ℃、50 s，72 ℃、1 min，30 個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠DNA回收，并與質(zhì)粒載體pMD18-T vector進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入100 μL E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白篩選之后，挑取單菌落在含有氨芐青霉素（50 mg/mL）的5 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒（30 μL），并送交博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較分析。綜合分析分離純化菌株的形態(tài)、生理生化和16S rDNA測(cè)序結(jié)果，判斷菌株的種屬分類地位。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次，數(shù)據(jù)以 ±s表示。運(yùn)用SPSS Statistics19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值和總酸含量變化結(jié)果

圖1 酸菜發(fā)酵過(guò)程中pH值和總酸含量的變化Fig. 1 Changes in pH value and acidity during fermentation of pickled Chinese cabbage

由圖1可知，在發(fā)酵起始階段（1 d），pH 5.5～5.7，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值呈現(xiàn)先急速下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，且BA中pH值下降速率快于CK。在發(fā)酵末期，BA的pH值略低于CK，分別為3.32±0.02和3.37±0.04。一般來(lái)說(shuō)，酸菜發(fā)酵液的pH值達(dá)到3.5～3.8，認(rèn)為酸菜已成熟，風(fēng)味品質(zhì)最佳，即可食用。

總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，且BA總酸含量增加速率快于CK。這是因?yàn)榘l(fā)酵初期，BA中L. casei 11MZ-5-1繁殖速率快，進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，CK中LAB含量較少，繁殖周期較長(zhǎng)，產(chǎn)酸量低于BA。同時(shí)，有機(jī)酸的大量積累，能夠抑制LAB菌群生長(zhǎng)，而L. casei 11MZ-5-1耐酸性較強(qiáng)，導(dǎo)致BA總酸含量持續(xù)增加。在發(fā)酵末期，總酸質(zhì)量濃度分別為（7.59±0.11）g/L（CK）和（7.88±0.09）g/L（BA）。

2.2 亞硝酸鹽含量和VC含量的變化

如圖2所示，CK中亞硝酸鹽的含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵第7天時(shí)出現(xiàn)一個(gè)明顯的亞硝酸鹽峰，峰值為（18.35±0.27）mg/kg，直至第17天幾乎消失。因?yàn)榘l(fā)酵初期，LAB含量較少，雜菌含量較多，尤其是含硝酸鹽還原酶的雜菌能夠?qū)⑾跛猁}還原成亞硝酸鹽，導(dǎo)致形成亞硝酸鹽峰[24]。而B(niǎo)A中始終沒(méi)有出現(xiàn)亞硝酸鹽峰，含量維持在1.00 mg/kg以下，在發(fā)酵末期為（0.27±0.04）mg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（20.00 mg/kg）。這是因?yàn)榘l(fā)酵初期L. casei 11MZ-5-1產(chǎn)生大量乳酸，有效抑制其他雜菌的活動(dòng)。

圖2 酸菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量和VC含量的變化Fig. 2 Changes in nitrite and VC content during fermentation of pickled Chinese cabbage

VC的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，在發(fā)酵末期趨于穩(wěn)定，且CK中VC含量下降速率快于BA。這是由于VC是己糖衍生物，易溶于水，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定[17]。L. casei 11MZ-5-1在BA中大量繁殖，迅速產(chǎn)酸，減慢VC的降解速率，在發(fā)酵15 d穩(wěn)定在438～445 mg/kg。CK中，發(fā)酵初期總酸含量較低，微生物種類比較復(fù)雜，更多地利用VC，使得VC含量下降較快，最終為（287.76±5.81）mg/kg，少于BA。因此可以看出，L. casei 11MZ-5-1作為發(fā)酵劑，不僅可以迅速降低發(fā)酵系統(tǒng)的pH值，還可以防止VC的降解，顯著改善酸菜的品質(zhì)。

2.3 風(fēng)味物質(zhì)的含量變化

由表1可知，乳酸在2 個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)中都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先急速上升后緩慢上升最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，在發(fā)酵末期質(zhì)量濃度達(dá)到最高，分別為（7.02±0.11）g/L（CK）和（8.98±0.46）g/L（BA）。乳酸是代表酸菜營(yíng)養(yǎng)程度的指標(biāo)，一般在乳酸含量不明顯增加的時(shí)間結(jié)束發(fā)酵，獲取酸菜產(chǎn)品[25]。本研究發(fā)現(xiàn)BA中乳酸的含量始終高于CK并先于CK達(dá)到最高值趨于穩(wěn)定。此趨勢(shì)與崔松林等[26]研究酸菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸變化情況相同。乙酸在兩種發(fā)酵系統(tǒng)中的變化趨勢(shì)與乳酸相一致，在發(fā)酵末期，質(zhì)量濃度分別為（0.53±0.02）g/L（CK）和（0.50±0.03）g/L（BA）。檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸含量呈現(xiàn)先上升后下降最終趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。檸檬酸可以為酸菜提供溫和爽快、有新鮮感的感官品質(zhì)，也是酸菜發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味形成的重要參考指標(biāo)。發(fā)酵末期，BA中有機(jī)酸的含量高于CK。出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)镃K中的細(xì)菌種類較多，影響或阻止了發(fā)酵過(guò)程的正向發(fā)展，而B(niǎo)A中由于外源的接入L. casei 11MZ-5-1，導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境相對(duì)較早的形成，菌體通過(guò)代謝產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，迅速降低發(fā)酵系統(tǒng)的pH值，縮短發(fā)酵周期。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，甘油含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，且BA高于CK，在發(fā)酵末期分別為（0.36±0.02）g/L和（0.31±0.03）g/L（P＜0.05）。甘露醇含量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，BA峰值出現(xiàn)早，在發(fā)酵末期，質(zhì)量濃度分別為（12.28±0.30）g/L（CK）和（13.82±0.42）g/L（BA）。乙醇含量變化趨勢(shì)同乳酸，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，含量不斷上升，在發(fā)酵末期保持穩(wěn)定，兩體系相差較小。2,3-丁二醇含量變化與甘油含量的變化趨勢(shì)一致，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且BA始終高于CK，在發(fā)酵末期分別為（0.13±0.02）g/L（CK）和（0.22±0.02）g/L（BA）（P＜0.05）。由上可知，在酸菜發(fā)酵末期，甘油、甘露醇、2,3-丁二醇在BA內(nèi)的含量高于CK。因此，L. casei 11MZ-5-1能夠顯著地改善酸菜的品質(zhì)，為酸菜帶來(lái)更豐富的風(fēng)味、口味。

表1 酸菜發(fā)酵過(guò)程中9 種代謝產(chǎn)物的含量Table 1 Contents of 9 metabolites during fermentation of pickled Chinese cabbage

如圖3所示，BA中揮發(fā)性化合物的總相對(duì)含量為（91.13±4.29）%，顯著高于CK（（78.44±2.61）%）（P＜0.05）。在BA樣品中，除烷類的含量顯著低于CK（（19.31±1.87）%）（P＜0.05），酯類、萜類、醛類、酮類、醚類、醇類、苯及衍生物類、萘及衍生物類、含硫化合物和雜環(huán)化合物的含量均高于CK。大量研究發(fā)現(xiàn)，烷類對(duì)酸菜風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小[27]；醛類可以賦予酸菜清香、堅(jiān)果香和果香[28]；酮類賦予酸菜奶油的香味；醇類賦予酸菜水果香、甜香以及酒香味[29]。L. casei 11MZ-5-1發(fā)酵酸菜中各揮發(fā)性化合物均處于較高水平，因此風(fēng)味濃郁。

圖3 酸菜樣品揮發(fā)性化合物相對(duì)含量Fig. 3 Relative contents of flavor compounds in pickled Chinese cabbage

2.4 酸菜感官評(píng)價(jià)結(jié)果

對(duì)比2 種酸菜樣品，BA樣品整體感官評(píng)分為（2.33±0.12）分，高于CK樣品（（1.87±0.06）分）。從色澤、香氣、口味、脆度等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，BA的分?jǐn)?shù)均高于CK（P＜0.05）。由此看出，L. casei 11MZ-5-1作為發(fā)酵劑可顯著改善酸菜的感官品質(zhì)。

2.5 L. casei 11MZ-5-1酸菜發(fā)酵過(guò)程中菌體的多樣性及演替分析

圖4 L. casei11MZ-5-1酸菜發(fā)酵過(guò)程中菌體數(shù)量變化Fig. 4 Change in bacterial number during L. casei 11MZ-5-1 fermentation of pickled Chinese cabbage

利用不同種類選擇培養(yǎng)基，分離酸菜發(fā)酵過(guò)程中的菌體，結(jié)果如圖4所示。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中共分離得到6 類菌體，分別為L(zhǎng)AB、好氧菌、Saccharomyces、Enterobacter、Enterococcus和E. coli，并未分離得到S. aureus、B. cereus、Clostridium difficile、L. monocytogenes和Salmonella。LAB作為優(yōu)勢(shì)菌在數(shù)量上呈現(xiàn)先增加后保持不變的趨勢(shì)，好氧菌則呈平穩(wěn)生長(zhǎng)趨勢(shì)；Saccharomycetes、Enterobacter、Enterococcus和E. coli的菌體數(shù)量則呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵末期，未檢測(cè)到Enterobacter、Enterococcus和E. coli。因此，可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，LAB逐漸成為發(fā)酵系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)菌，主導(dǎo)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，而Enterobacter等菌體因?yàn)槟退崮芰^低，不能在較酸的環(huán)境下生存，因此隨著LAB數(shù)量的增加逐漸減少。

2.6 L. casei 11MZ-5-1酸菜發(fā)酵過(guò)程中菌體種類鑒定結(jié)果

本研究從L. casei 11MZ-5-1酸菜發(fā)酵液中共分離得到14 株細(xì)菌，少于自然酸菜發(fā)酵液（18 株）[18]，分別編號(hào)1～14。14 株細(xì)菌的顯微形態(tài)及菌落形態(tài)統(tǒng)計(jì)如表2所示。其中MRS培養(yǎng)基中共分離出5 株LAB，多于其他種類菌體，菌體直徑均小于1 mm，呈乳白色、桿狀，革蘭氏陽(yáng)性（G+）；PCA培養(yǎng)基中分離出的菌體，菌落大小不一，表面光滑，菌體形態(tài)為球狀。從BP、YPD、VRBA和KAA培養(yǎng)基中分別分離出2、2、1 種和2 種菌體，其中9號(hào)菌為紅色，顯著有別于其他菌體。

表2 L. casei 11MZ-5-1酸菜發(fā)酵系統(tǒng)中菌株菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征Table 2 Colony and microscopic morphology of bacteria isolated from L.casei 11MZ-5-1 fermented Chinese cabbage samples

經(jīng)生理生化鑒定及16S rDNA鑒定（表3），結(jié)果顯示1號(hào)為L(zhǎng). casei，NCBI序列比對(duì)結(jié)果與菌株NC014334.1具有較高的相似度，且結(jié)果與先前的研究一致[19]；3、4號(hào)為L(zhǎng). brevis，且NCBI序列比對(duì)結(jié)果與菌株AP012167.1具有較高的相似度，因此將這2 株菌統(tǒng)一分類為同一株L. brevis；7和13號(hào)為未培養(yǎng)細(xì)菌；2號(hào)為L(zhǎng)actobacillus；5號(hào)為L(zhǎng). plantarum；6號(hào)為Acinetobacter sp.，8號(hào)為Enterobacter sp.，9號(hào)為Klebsiella pneumoniae，10號(hào)為C. albicaus；11號(hào)為Saccharomyces，12號(hào)為E. coli，14號(hào)為Staphylococcus sp.。賀稚非等[30]通過(guò)對(duì)酸菜發(fā)酵過(guò)程中微生物群落進(jìn)行分析得出，在酸菜發(fā)酵過(guò)程中，原料表面上的微生物生長(zhǎng)繁殖，主要有Saccharomyces、Lactococcus、Pseudomonas、Enterobacter等；同時(shí)，LAB也有所增加，主要為L(zhǎng)actococcus、Leuconostoc和Pediococcus等，但產(chǎn)酸量低；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入中期時(shí)，Lactobacillus大量繁殖，產(chǎn)生較強(qiáng)的酸性、缺氧環(huán)境，使得不耐酸的Enterobacter等細(xì)菌以及霉菌受到抑制；隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，發(fā)酵液中的微生物主要是Lactobacillus、Lactococcus和Saccharomyces。本研究BA中菌群的演替情況與前者的研究較為相似。因此可以看出L. casei 11MZ-5-1作為發(fā)酵劑，不僅可以防止腐敗菌的生成，減少發(fā)酵系統(tǒng)中菌群的種類及數(shù)量，還可以縮短發(fā)酵周期，使發(fā)酵系統(tǒng)向正向快速發(fā)展。

表3 L. casei11MZ-5-1酸菜發(fā)酵過(guò)程中分離菌株16S rDNA BLAST比對(duì)結(jié)果Table 3 16S rDNA sequence analysis by BLAST of strains isolated from L.casei11MZ-5-1 fermented Chinese cabbage pickle

3 結(jié) 論

本研究以分離自酸菜發(fā)酵液的L. casei 11MZ-5-1為發(fā)酵劑，對(duì)比分析L. casei 11MZ-5-1發(fā)酵酸菜和自然發(fā)酵酸菜樣品重要代謝物、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量及菌群分布情況?？偹岷颗cVC含量呈正相關(guān)，與亞硝酸鹽含量呈負(fù)相關(guān)。其中L. casei 11MZ-5-1發(fā)酵酸菜中，總酸含量較高，VC含量最大，亞硝酸鹽含量最低，甘油、甘露醇、2,3-丁二醇等有益代謝產(chǎn)物及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量高于自然酸菜發(fā)酵微生物生態(tài)系統(tǒng)。此外，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩體系中細(xì)菌大量繁殖。自然酸菜發(fā)酵微生物生態(tài)系統(tǒng)微生物種類高于L. casei 11MZ-5-1發(fā)酵酸菜微生物生態(tài)系統(tǒng)，且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，L. casei始終保持優(yōu)勢(shì)地位。由此可以看出，L. casei 11MZ-5-1作為酸菜發(fā)酵劑，可以增加酸菜的總酸含量，降低亞硝酸鹽含量，防止VC降解，加強(qiáng)風(fēng)味物質(zhì)含量，防止腐敗菌的生長(zhǎng)，從而提高酸菜安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。