孔維寶，楊 洋，陳 冬，汪 洋，達文燕，牛世全

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

類胡蘿卜素是一類含有40 個碳的類異戊烯四萜化合物及其衍生物的總稱，外觀呈黃色、橙紅色或紅色，分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類。自然界中，類胡蘿卜素主要由一些高等植物和微生物合成；人體因自身不能合成類胡蘿卜素，主要從日常膳食中攝取。類胡蘿卜素不僅是人類膳食營養(yǎng)中重要的組成部分，具有VA的活性，而且還具有抗氧化、預(yù)防夜盲癥、抗癌等藥理作用，在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域具有廣泛用途[1-2]。

目前，生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法主要有植物提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。其中微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)原料不受限制、易于工業(yè)化生產(chǎn)、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率高、天然安全、色澤豐富等優(yōu)勢，逐漸成為類胡蘿卜素生產(chǎn)的主要方法[3]。合成類胡蘿卜素的主要微生物種類有光合細菌、杜氏藻、雨生紅球藻、三孢布拉霉、卷枝毛霉、紅酵母等[4-6]。Buzzini等[7]研究了Rhodotorula、Rhodosporidium、Sporobolomyces和Sporidiobolus 4 個屬的13 個菌株積累色素的情況，將培養(yǎng)5 d的菌體收集，測得總色素含量（以干菌體計）為16.40～184.00 μg/g，經(jīng)色譜鑒定主要組分為紅酵母紅素、紅酵母烯、γ-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。樊竹青等[8]對分離自云南撫仙湖水的379 株酵母菌進行產(chǎn)類胡蘿卜素的篩選研究結(jié)果顯示，83.91%的供試菌具有產(chǎn)類胡蘿卜素的能力，大部分菌株產(chǎn)量在10～300 μg/g之間，最高達590.83 μg/g；產(chǎn)類胡蘿卜素酵母集中分布于紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）和紅酵母屬（Rhodotorula），擔子菌酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的能力高于子囊菌酵母。Chagas等[9]設(shè)計了微藻光生物反應(yīng)器與酵母發(fā)酵集成培養(yǎng)裝置，研究利用啤酒發(fā)酵時產(chǎn)生的CO2培養(yǎng)杜氏鹽藻用于類胡蘿卜素的生產(chǎn)，結(jié)果顯示類胡蘿卜素的產(chǎn)量（以干菌體計）可達4.74 g/g，產(chǎn)率可達0.86 mg/（L·d）。以Rhodotorula glutinis YB-252為菌種采用固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)類胡蘿卜素時，在優(yōu)化條件下可獲得340 mg/L的番茄紅素[10]。

但是，目前用于工業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物菌種還十分有限，從自然界中篩選高產(chǎn)類胡蘿卜素的優(yōu)良菌種仍具有較高的研究和開發(fā)價值。本實驗結(jié)合傳統(tǒng)和現(xiàn)代微生物分類學(xué)方法，對1 株從土壤中分離獲得的具有類胡蘿卜素生產(chǎn)潛力的菌株進行鑒定，測定其生長特性和類胡蘿卜素的穩(wěn)定性，并優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基組成，旨在為采用發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素提供菌種資源和工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

產(chǎn)色素菌株K-1由本實驗室從土壤中分離純化并保藏。

1.1.2 試劑

牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、瓊脂等試劑購自青島海博生物技術(shù)有限公司，其他化學(xué)試劑均為分析純；12.5%豆芽汁、牛板油等為自制。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、牛奶胨化培養(yǎng)基、產(chǎn)脂培養(yǎng)基等生理生化鑒定培養(yǎng)基的配制方法參考文獻[11-12]；YEPD培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，115 ℃滅菌15 min，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂粉，pH 6.0；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO41 g/L、無水MgSO40.5 g/L、CaCl20.1 g/L、NaCl 0.1 g/L、pH 5.5；培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CP114電子分析天平 美國奧豪斯公司；GI54T立式高壓蒸汽滅菌鍋 美國致微公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-2800紫外-可見分光光度計 上海優(yōu)尼柯公司；ZWYR-211D大容量恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；DHG型電熱恒溫干燥箱 上?，槴\實驗設(shè)備有限公司；研究級倒置熒光顯微鏡 德國Leika公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的鑒定

1.3.1.1 菌株K-1的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

參照文獻[13]進行實驗。

1.3.1.2 菌株K-1的分子生物學(xué)鑒定方法

參照文獻[14]方法對菌株的DNA基因組進行提取，使用真菌核糖體ITS基因片段的通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR總體系為20 μL：2×Taq PCR StarMix 10 μL，上下游引物各取1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補至20 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將擴增后的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收后進行測序。測序后將結(jié)果輸入NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST程序進行同源序列比較分析，采用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建所測菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1 000 次。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取、定性及胞外穩(wěn)定性測定

類胡蘿卜素提取：菌體破壁處理采用改良過的酸熱法[15-16]，用丙酮作提取劑[17]。準確稱量0.1 g凍干的菌體干粉，加入6 mL 3 mol/L HCl溶液，置于渦旋混合器上充分混勻10 min，沸水浴處理6 min，置于冰浴中速冷6 min，4 000 r/min離心15 min，棄去上清液后用蒸餾水洗滌菌體2 次，4 000 r/min離心15 min后去除上清液。向已破壁處理的菌體中加入6 mL丙酮，置于渦旋器上充分混合3 min，重復(fù)提取至菌體變白且無明顯顏色變化，合并提取液，用丙酮定容后測定。

類胡蘿卜素的定性：在取少量上述實驗得到的丙酮浸提液置于平面皿中，放置數(shù)分鐘適當?shù)渭?滴濃硫酸，以丙酮作為空白對照，若變藍色或藍綠色，則可證明丙酮浸提液中含有類胡蘿卜素。采用分光光度法將色素丙酮浸提液在380～800 nm波長下進行全波長掃描，確定最大吸收波長，并對該菌色素特征吸收峰進行光譜分析[18-19]。

類胡蘿卜素提取液的穩(wěn)定性測定：將類胡蘿卜素的丙酮提取液置于系列溫度梯度環(huán)境中30 min后，測定吸光度A486nm變化，考察溫度對其穩(wěn)定性的影響；將提取液置于0、2 600、6 400 lx光照強度下24 h后，測定其吸光度A486nm，考察光強度對其穩(wěn)定性的影響；向類胡蘿卜素丙酮提取液中分別加入0.1 mL 3% H2O2溶液、0.01%二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）溶液，以丙酮浸提液為空白對照，置于室溫下避光放置24 h后測定A486nm變化，考察氧化劑和抗氧化劑對其穩(wěn)定性的影響。結(jié)果以吸光度下降率表示，按式（1）計算：

式中：Ai為起始A486nm；Ae為放置24 h后的A486nm。

1.3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.3.1 種子液的制備及發(fā)酵條件

將菌種從斜面活化培養(yǎng)基中接入裝有50 mL液體YEPD種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后，再將其以10%的接種量接入裝有50 mL液體YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，將該培養(yǎng)液作為種子液用于接種發(fā)酵。

液態(tài)發(fā)酵條件均為裝液量50 mL/250 mL三角瓶、接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度 （30±2）℃，培養(yǎng)基初始pH 5.5，培養(yǎng)5 d后，分離提取，測定菌體質(zhì)量濃度和類胡蘿卜素產(chǎn)量。

1.3.3.2 單因素試驗

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油等碳源種類（添加量均為30 g/L）及葡萄糖質(zhì)量濃度（20、30、40、50、60 g/L），酵母粉、蛋白胨、(NH4)2SO4等氮源種類（添加量均為5 g/L）及(NH4)2SO4質(zhì)量濃度（5、10、15、20、25、30、40、50 g/L），K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度（0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25 g/L），無水CaCl2質(zhì)量濃度（0、1、2、3、4、5 g/L），檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度（0、2.5、5.0、7.5、10、12.5 g/L）對菌株K-1生長及類胡蘿卜素合成的影響，根據(jù)類胡蘿卜素產(chǎn)量篩選影響顯著的因素和水平，以便進一步采用正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

1.3.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量濃度對菌株K-1菌體和類胡蘿卜素產(chǎn)量的綜合影響，篩選影響較為顯著的葡萄糖、(NH4)2SO4、無水CaCl2、檸檬酸三鈉4 個影響因素，采用4因素3水平正交試驗（表1）設(shè)計方案進一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

表1 L9（34）正交試驗設(shè)計Table 1 Code and level of independent variables used for L9 (34) orthogonal array design g/L

1.3.4 指標的測定

1.3.4.1 菌體質(zhì)量濃度的測定

吸取4 mL發(fā)酵液加入已烘干稱質(zhì)量的5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，棄去上清液后菌體沉淀物用蒸餾水洗滌，同樣條件下離心后棄去上清液，含菌體的離心管在105 ℃烘干至恒質(zhì)量，置于干燥器中冷卻至室溫后稱質(zhì)量，按式（2）計算菌體質(zhì)量濃度：

式中：M1為帶菌體管干質(zhì)量/g；M為空管干質(zhì)量/g；V為發(fā)酵液體積/mL。

1.3.4.2 類胡蘿卜素產(chǎn)量的測定

向破壁菌體中加入6 mL丙酮后充分混合，重復(fù)提取至菌體變白，合并提取液，用丙酮定容后待測。提取液適當稀釋后用比色法測定類胡蘿卜素產(chǎn)量，測定波長為486 nm，根據(jù)文獻[6,16-19]方法計算類胡蘿卜素產(chǎn)量，計算見公式（3）：

式中：A為類胡蘿卜素最大吸收波長下的吸光度；D為樣品稀釋倍數(shù)；V為提取所用溶劑體積/mL；m為菌體干質(zhì)量/g；0.16為類胡蘿卜素消光系數(shù)/（L/mg）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Excel 2010軟件，顯著性分析采用SPSS 19.0軟件，正交試驗設(shè)計采用正交設(shè)計助手II 3.1軟件。數(shù)據(jù)以 ±s表示（n=3），P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株K-1的鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在培養(yǎng)基中點植接種，15 d后能夠形成直徑約為（1.9±0.1）cm的菌落（圖1A），菌落顏色由白色逐漸變?yōu)槌燃t色，表面光亮，有時呈現(xiàn)網(wǎng)狀或縮成波狀，質(zhì)地軟而呈黏狀。培養(yǎng)基顏色未有明顯變化，無滲出物形成，氣味為特殊臭味。通過玉米粉瓊脂培養(yǎng)基進行蓋片培養(yǎng)，未觀察到假菌絲。

圖1 菌株K-1的形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of strain K-1

在麥芽汁培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)3～5 d，細胞為短卵形，單個或者成對，細胞大小為3～6 μm，能形成完整環(huán)和沉淀，培養(yǎng)1 個月以上，菌體呈現(xiàn)深粉紅色，可形成醭，菌體呈黏液狀，為出芽生殖（圖1B），不能形成子囊孢子和擲孢子。

2.1.2 生理生化鑒定

表2 菌株K-1的碳源同化測試結(jié)果Table 2 Carbon source assimilation pattern of strain K-1

由表2可知，碳源同化實驗結(jié)果顯示，該菌株能利用葡萄糖、果糖等12 種糖，不能利用乳糖和可溶性淀粉，能利用甘油、甘露醇、檸檬酸、蘋果酸、氨基乙酸，不能利用對氨基苯甲酸、乙醇、肌醇、山梨醇和山梨酸；氮源同化實驗結(jié)果顯示，該菌不能利用尿素，能利用硫酸銨、蛋白胨和酵母膏，能利用VB1和VB6；生理生化檢測結(jié)果顯示，該菌不能在無維生素的環(huán)境中生長，不能利用硝酸鉀，5 g/L的亞硝酸鈉對菌體有強的致死作用，可使牛奶發(fā)生胨化，不產(chǎn)芳香物質(zhì)，不能使明膠液化，可在50%高滲培養(yǎng)基上生長。

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，目的基因PCR產(chǎn)物約為620 bp。將菌株K-1 ITS序列通過BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)已報道的ITS基因序列進行相似性比對分析，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖3所示。結(jié)果顯示，菌株K1與膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的相似性為99%，并結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特性初步鑒定為膠紅酵母。

圖2 菌株K-1 PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 2 Electrophoresis pattern of PCR products of genomic DNA from strain K-1

圖3 基于菌株K-1的ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain K-1 based on ITS sequences

2.2 菌株K-1產(chǎn)類胡蘿卜素的定性及穩(wěn)定性結(jié)果

2.2.1 色素定性

圖4 膠紅酵母K-1丙酮提取物的可見光波長掃描Fig. 4 Visible absorption spectrum of the acetone extract from R. mucilaginosa K-1

將菌體丙酮提取液在380～800 nm波長下進行掃描。由圖4可知，菌株K-1的丙酮提取液在486 nm波長處存在最大吸收峰，將此結(jié)果與Perrier等[20]在486 nm波長下不同類胡蘿卜素特征吸收峰進行比對，初步確定該菌體K-1色素含有多種類胡蘿卜素混合物。將此結(jié)果與Fraser等[21]的研究中膠紅酵母CBS316主要的3 種類胡蘿卜素的吸收光譜相比較，在484 nm波長處有最大吸收峰的色素為紅酵母烯。其中對類胡蘿卜素測定方法的描述中，確定其比色法檢測時的波長為486 nm，該結(jié)果與菌株K-1的丙酮浸提液存在最大吸收峰的結(jié)果一致。

2.2.2 色素胞外穩(wěn)定性結(jié)果

圖5 膠紅酵母K-1的色素穩(wěn)定性測試結(jié)果Fig. 5 Stability of the pigments from R. mucilaginosa K-1

將K-1菌體類胡蘿卜素丙酮浸提液稀釋至486 nm波長處的吸光度為0.426，分別放置在不同的溫度、光照、氧化劑和還原劑的條件下測定計算A486nm下降率，考察其胞外穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。在20～100 ℃溫度范圍內(nèi)將色素提取物處理30 min后，其A486nm隨處理溫度的升高而不斷增大，在60、100 ℃下處理30 min后A486nm的下降率分別為13.62%和22.85%，說明低溫處理有利于保護其穩(wěn)定性，而高溫具有破壞作用，由此也反映出該色素提取物具有較好的熱穩(wěn)定性。色素提取物在室溫下放置24 h，光照強度為6 400 lx處理組的A486nm下降率最快，為56.42%，而2 600 lx光照強度處理組的下降率為34.19%，而0 lx對照組的下降率為12.75%，這一結(jié)果說明光照強度對K-1菌株產(chǎn)類胡蘿卜素的胞外穩(wěn)定性有顯著影響，因此在保存時要盡量采取避光措施。

類胡蘿卜素是一種抗氧化劑，其在生物體內(nèi)能起到良好的抗氧化作用[22]。H2O2和BHT分別是常用的氧化劑和抗氧化劑，所以用這2 種物質(zhì)對受試類胡蘿卜素的胞外穩(wěn)定性進行評價。與對照組相比，加入氧化劑H2O2的受試組吸光度下降率高于對照組，而添加BHT組吸光度較對照組低，這說明H2O2處理對K-1菌體所產(chǎn)類胡蘿卜素的胞外穩(wěn)定性影響較小，BHT能夠保護和維持菌體類胡蘿卜素的胞外穩(wěn)定性。本實驗有關(guān)膠紅酵母色素耐熱性、光照穩(wěn)定性，以及氧化劑穩(wěn)定性的研究結(jié)果總體趨勢與韓永斌等[23]有關(guān)光合細菌類胡蘿卜素穩(wěn)定性研究的結(jié)果相似。

2.3 碳源和氮源種類及質(zhì)量濃度對K-1菌株產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

2.3.1 碳源種類的影響

碳源對微生物中含碳物質(zhì)的合成至關(guān)重要，尤其在探討影響類胡蘿卜素合成的因素過程中，對碳源的研究最多[24]。酵母菌代謝行為也會因碳源的種類不同而改變。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源設(shè)置為葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖4 種碳源進行碳源篩選實驗。從表3得出，以葡萄糖為碳源時，菌體質(zhì)量濃度（以干質(zhì)量計，下同）、類胡蘿卜素產(chǎn)量均較其他受試碳源高。蔗糖在菌體質(zhì)量濃度和類胡蘿卜素產(chǎn)量上略低于葡萄糖。麥芽糖和甘油的影響相當，菌體質(zhì)量濃度和類胡蘿卜素產(chǎn)量相對較低。因此，在后續(xù)實驗中選用葡萄糖作為碳源。

表3 碳源對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of carbon sources on carotenoid yield of R. mucilaginosaK-1

2.3.2 葡萄糖質(zhì)量濃度的影響

由表4可以得出，葡萄糖質(zhì)量濃度30 g/L時類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達到（155.36±4.91）μg/g；葡萄糖質(zhì)量濃度60 g/L下菌體質(zhì)量濃度最高；葡萄糖質(zhì)量濃度在高于30 g/L時，隨著質(zhì)量濃度的增加類胡蘿卜素產(chǎn)量呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能與菌體生長量的上升有關(guān)。由計算葡萄糖不同質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中的碳氮比發(fā)現(xiàn)，碳氮比在11～33范圍內(nèi)，類胡蘿卜素產(chǎn)量之間無顯著性差異，但隨著碳氮比的提高，類胡蘿卜素產(chǎn)量呈下降趨勢。Aksu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在以葡萄糖、糖蜜蔗糖、乳清乳糖為碳源，以膠紅酵母為菌種發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素時，總體上隨著糖濃度的增加，酵母的生長和類胡蘿卜素產(chǎn)量也隨之提高，當蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L時，發(fā)酵液中類胡蘿卜素的最高產(chǎn)量可達89.0 mg/L。因此，從促進菌體生長和積累合成類胡蘿卜素，以及節(jié)約成本的角度考慮，應(yīng)控制好培養(yǎng)基中葡萄糖的質(zhì)量濃度。

2.3.3 氮源種類的影響

已有研究表明，氮源種類和濃度對紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素同樣具有重要的影響[26-27]。從表5可以看出，在3 種氮源中，以酵母粉為氮源時，菌體質(zhì)量濃度最高，類胡蘿卜素產(chǎn)量較大；(NH4)2SO4組菌體生長量最小，但其類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達到（147.16±2.27）μg/g。從類胡蘿卜素的產(chǎn)量和生產(chǎn)成本綜合考慮，(NH4)2SO4可作為該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的適宜氮源。

表5 氮源對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Table 5 Effect of nitrogen sources on carotenoid yield of R. mucilaginosaK-1

2.3.4 (NH4)2SO4質(zhì)量濃度的影響

表6 (NH4)2SO4對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Table 6 Effect of (NH4)2SO4 concentration on carotenoids yield of R. mucilaginosaK-1

從表6可以看出，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量濃度的增加，菌體質(zhì)量濃度也呈現(xiàn)增長趨勢。40～50 g/L時菌體質(zhì)量濃度最大；質(zhì)量濃度25 g/L時菌體類胡蘿卜素產(chǎn)量最大，達到（167.62±2.84）μg/g。

2.4 無機鹽種類和質(zhì)量濃度對K-1菌株產(chǎn)類胡蘿卜素的影響

2.4.1 K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度的影響

K2HPO4·3H2O為菌體的生長提供鉀源和磷源，鉀元素和磷元素是菌體生長必需的元素，K2HPO4·3H2O也能為穩(wěn)定培養(yǎng)基的pH值起到微緩沖作用。唐棠等[28]在優(yōu)化紅酵母Y-5產(chǎn)類胡蘿卜素培養(yǎng)基無機鹽組分的研究時，從8 種無機鹽中篩選出對提高類胡蘿卜素產(chǎn)量具有顯著效應(yīng)的無機鹽組分為KH2PO4、MgSO4和NaCl。由表7可以得出，在0.25～1.25 g/L的范圍內(nèi)，K2HPO4·3H2O對提高膠紅酵母菌體質(zhì)量濃度有著顯著作用，當K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度為0.25 g/L時，類胡蘿卜素產(chǎn)量達到最大值（161.89±3.86）μg/g，且隨著質(zhì)量濃度的增加而降低。徐軍等[27]在研究無機鹽和碳氮源對青霉PT95類胡蘿卜素產(chǎn)率的影響時也發(fā)現(xiàn)，供試的4 種無機鹽中，K2HPO4的單因子效應(yīng)最好，K2HPO4＋KCl＋MgSO4表現(xiàn)出最好的正協(xié)同效應(yīng)。綜上分析說明，磷源對于菌體產(chǎn)類胡蘿卜素具有重要的影響。

表7 K2HPO4·3H2O對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Table 7 Effect of K2HPO4·3H2O concentration on carotenoids yield of R.mucilaginosaK-1

2.4.2 無水CaCl2質(zhì)量濃度的影響

表8 無水CaCl2對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Table 8 Effect of CaCl2 concentration on carotenoids yield of R. mucilaginosaK-1

CaCl2主要為菌體提供Ca2＋。Ca2＋是維持菌體滲透壓的重要離子，還是某些酶的輔因子，并能維持一些微生物蛋白酶的穩(wěn)定性。由表8可知，當培養(yǎng)基中無水CaCl2質(zhì)量濃度為3 g/L時，類胡蘿卜素產(chǎn)量達到最大值（139.95±0.46）μg/g，在質(zhì)量濃度2 g/L時，其菌體質(zhì)量濃度達11.22 g/L。唐剛等[29]在研究間型脈孢菌產(chǎn)類胡蘿卜素時發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中添加了1.5 mg/L沒食子酸和0.05 g/L植酸鈣后，所培養(yǎng)菌絲中類胡蘿卜素含量分別可達46.44 μg/g和54.03 μg/g，比對照分別提高了100%和133%。呂和鑫等[30]的研究也表明鈣離子補料能提高杜氏鹽藻細胞中類胡蘿卜素產(chǎn)量。上述研究結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加一定濃度的鈣鹽有利于菌體合成和積累類胡蘿卜素。

2.4.3 檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度的影響

檸檬酸既可作為部分微生物的碳源，也可以作為很好的細胞生長及代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)因子。廖春麗等[31]用三孢布拉霉（Blakeslea trispora）液體發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素時發(fā)現(xiàn)，檸檬酸濃度對產(chǎn)物β-胡蘿卜素的產(chǎn)量影響顯著。由表9可以看出，檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度為2.5 g/L時，菌體質(zhì)量濃度達到最大值，檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度為7.5 g/L時，菌體類胡蘿卜素產(chǎn)量最高可達（167.40±4.12）μg/g，但與5 g/L和10 g/L相比沒有顯著差異。本研究結(jié)果也顯示檸檬酸鹽對膠紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素具有促進作用。

表9 檸檬酸三鈉對膠紅酵母K-1類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Table 9 Effect of trisodium citrate concentration on carotenoids yield of R. mucilaginosaK-1

2.5 正交試驗優(yōu)化菌株K-1產(chǎn)類胡蘿卜素結(jié)果

表10 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 10 Experimental design and results of L9 (34) orthogonal array

從提高類胡蘿卜素的發(fā)酵產(chǎn)量考慮，一方面應(yīng)保證較高的菌體濃度，另一方面應(yīng)盡量提高菌體中目標產(chǎn)物的量。根據(jù)單因素試驗結(jié)果分析可知，碳源和氮源對菌體質(zhì)量濃度的影響較為顯著，而無水CaCl2和檸檬酸三鈉對菌體細胞中類胡蘿卜素產(chǎn)量的積累影響較為顯著。因此，選擇葡萄糖、(NH4)2SO4、無水CaCl2和檸檬酸三鈉4 個對菌體質(zhì)量濃度和色素產(chǎn)量影響較為顯著的營養(yǎng)物質(zhì)，設(shè)計4因素3水平正交試驗，進一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成。其他發(fā)酵條件同單因素試驗條件，正交試驗設(shè)計及結(jié)果如表10所示。

表11 正交試驗結(jié)果方差分析Table 11 Analysis of variance of the results from orthogonal array design

由表10可知，影響類胡蘿卜素產(chǎn)量的因素主次順序為：葡萄糖質(zhì)量濃度＞無水CaCl2質(zhì)量濃度＞檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度＞(NH4)2SO4質(zhì)量濃度；最優(yōu)水平最佳組合為A1B1C1D1，即葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO420g/L，無水CaCl22 g/L，檸檬酸三鈉 5 g/L。在此基礎(chǔ)上，對正交試驗結(jié)果進行方差分析，見表11。結(jié)果表明：葡萄糖對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響顯著（P＜0.05）；而(NH4)2SO4、無水CaCl2和檸檬酸三鈉對類胡蘿卜素產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05）。對最優(yōu)水平進行驗證實驗，類胡蘿卜素產(chǎn)量為（180.14±2.45）μg/g。發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化后，類胡蘿卜素產(chǎn)量比未優(yōu)化前提高了43.13%。

3 結(jié) 論

在玉米粉瓊脂、麥芽汁等培養(yǎng)基上對菌株K-1進行形態(tài)學(xué)鑒定；生理生化檢測結(jié)果顯示，該菌株能利用葡萄糖、果糖等12 種糖以及甘油、甘露醇、檸檬酸、蘋果酸、氨基乙酸等物質(zhì)可作為碳源，還能以(NH4)2SO4、蛋白胨和酵母膏等作為氮源，但不能利用KNO3，不產(chǎn)芳香物質(zhì)，不能在無維生素的環(huán)境中生長，5 g/L的NaNO2對菌體有致死作用；將菌株K-1測序所得的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，最終鑒定該菌株為R. mucilaginosa，即膠紅酵母。

對菌體的丙酮提取液進行波長掃描，在486 nm波長處存在最大吸收峰，與已報道的紅酵母烯的最大吸收峰相近，表明提取物中的主要成分可能為紅酵母烯。

將膠紅酵母K-1丙酮浸提液在不同溫度、光照、氧化劑和還原劑條件下處理，考察其胞外穩(wěn)定性，結(jié)果顯示低溫、避光處理有利于維持其穩(wěn)定性，高溫、強光照對其穩(wěn)定性有破壞作用，H2O2處理對其胞外穩(wěn)定性影響較小，BHT能夠保護和維持其胞外穩(wěn)定性。

選取碳源、氮源、無機鹽種類及其質(zhì)量濃度作為試驗因素，類胡蘿卜素產(chǎn)量作為衡量指標，結(jié)合單因素和正交試驗優(yōu)化了菌株K-1產(chǎn)類胡蘿卜素的培養(yǎng)基組成，最終確定其優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為20 g/L葡萄糖、20 g/L(NH4)2SO4、2 g/L無水CaCl2、5 g/L檸檬酸三鈉（培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、裝瓶量50 mL/250 mL、初始pH 5.5、培養(yǎng)5 d），該優(yōu)化條件下類胡蘿卜素產(chǎn)量（干質(zhì)量計）可達（180.14±2.45）μg/g，比未優(yōu)化前的提高了43.13%。

研究表明，膠紅酵母K-1生長性能良好、色素穩(wěn)定性高，具有發(fā)酵高產(chǎn)類胡蘿卜素的潛能。參考文獻：

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