陳 韻，鐘先鋒，陸麗珠，張 瑾，梁舒妍，江志彬，王漫君

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528225）

微生物油脂也稱單細(xì)胞油脂，可由多種產(chǎn)油微生物產(chǎn)生，包括絲狀真菌、微藻、細(xì)菌、酵母菌等[1]。根據(jù)油脂的脂肪酸組成不同，微生物油脂可用于多種用途。富含飽和及低度不飽和的長鏈脂肪酸，且脂肪酸組成與動(dòng)植物油相似的微生物油脂，可用于生產(chǎn)生物柴油或可可脂替代品[2]。另一方面，微生物油具有豐富的多不飽和脂肪酸（PUFAs），可以應(yīng)用于保健品和必需脂肪酸的生產(chǎn)[3]。

產(chǎn)油微生物種類繁多，就單細(xì)胞油脂的生產(chǎn)而言，酵母菌與其他微生物相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，與微藻相比，酵母菌的發(fā)酵受氣候的影響較小，另一方面，酵母菌還可以利用多種多樣的糖類和其他簡單化合物作為碳源。再者，與真菌相比，酵母菌對氧氣的需求量更低，對金屬離子也具有更高的耐受性。此外，由于細(xì)胞體積較大，酵母菌細(xì)胞比細(xì)菌更容易收獲。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，與其他微生物相比，酵母菌較容易進(jìn)行基因工程改造。因其優(yōu)點(diǎn)突出，含油酵母的脂質(zhì)生產(chǎn)在近幾年來一直是各國的研究熱點(diǎn)之一[4]。但含油酵母菌產(chǎn)油發(fā)酵受多種因素影響，主要有pH 值、溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、溶氧量等的培養(yǎng)環(huán)境條件和碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、前體物質(zhì)等培養(yǎng)基成分[5]。在利用酵母菌發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程中，通過控制培養(yǎng)環(huán)境條件和添加不同的營養(yǎng)成分，可得到不同脂肪酸組成的微生物油脂，實(shí)現(xiàn)微生物油脂在不同行業(yè)中的應(yīng)用[6]。主要針對影響產(chǎn)油酵母菌發(fā)酵產(chǎn)油脂的培養(yǎng)環(huán)境條件和培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行了綜述，以期為產(chǎn)油酵母菌生產(chǎn)微生物油脂的工業(yè)化發(fā)展提供參考。

1 產(chǎn)油酵母

在已知的約600 種酵母中，只有不到30 種是產(chǎn)油酵母，其中有代表性的有耶氏酵母屬、隱球酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、根霉菌屬、毛孢子菌屬和油脂酵母屬[7]。大多數(shù)油脂酵母體內(nèi)油脂含量達(dá)40%，一些產(chǎn)油酵母菌株甚至可以積累高達(dá)70%的中性脂質(zhì)。

常見的油脂酵母主要有解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、斯達(dá)氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）、圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum）、彎曲隱球酵母（Cryptococcus curvata）、白色隱球酵母（Cryptococcus albidus），其中解脂耶氏酵母被證明可以將農(nóng)用工業(yè)殘留物、工業(yè)甘油和廢棄脂肪轉(zhuǎn)化為甘油三酯[8]；圓紅冬孢酵母油脂含量最高，但利用廢液的能力較差[9]。

2 影響產(chǎn)油酵母生產(chǎn)油脂的環(huán)境條件

2.1 接種量

接種量能夠影響酵母菌的生長和油脂產(chǎn)量[10]。接種量較小時(shí)，發(fā)酵液中的生物量較少，油脂產(chǎn)量會(huì)相對較少；接種量越大，一般越有利于細(xì)胞生長，但脂質(zhì)積累有最佳的接種濃度。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著接種量增加，油脂產(chǎn)量不斷增加并達(dá)到較大產(chǎn)量，繼續(xù)增加接種量，油脂產(chǎn)量反而會(huì)下降[11]。據(jù)Liu L P 等人[12]推測，較高的接種量有利于細(xì)胞內(nèi)多糖的合成，因此接種量越高菌體生長越旺盛，但較高的接種量可能會(huì)增加氮濃度，從而誘導(dǎo)降低發(fā)酵培養(yǎng)基中C/N 比，而這是不利于脂質(zhì)積累的。Chen X F 等人[13]也發(fā)現(xiàn)在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物上進(jìn)行產(chǎn)脂發(fā)酵時(shí)，過高的接種量不利于微生物油脂的積累。

2.2 pH 值

pH 值是影響微生物正常生命活動(dòng)的重要因素。培養(yǎng)基pH 值會(huì)影響到合成油脂過程中關(guān)鍵酶的活性和微生物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。當(dāng)pH 值發(fā)生變化時(shí)，發(fā)酵液中離子的濃度也會(huì)發(fā)生改變，過高或過低的離子濃度都會(huì)影響細(xì)胞對培養(yǎng)基中離子的吸收和利用，最終影響菌體的生產(chǎn)繁殖和油脂積累[14]。胡洋[15]考查了pH 值4.0～8.0 對T. fermentans，T. cutaneum 和L. starkeyi 產(chǎn)油脂的影響，隨著pH 值增大時(shí)，3 種酵母菌的生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)率都在不斷增大；當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH 值超過6.0 時(shí)，以上指標(biāo)均開始減小。周晶[16]也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵液的pH 值過高或過低時(shí)，菌體生長繁殖都會(huì)受到抑制。

2.3 溫度

溫度是酵母菌培養(yǎng)最重要的環(huán)境因素之一，通常在最終發(fā)酵油脂產(chǎn)量中起關(guān)鍵作用。大多數(shù)酵母菌的最佳發(fā)酵溫度為28～32 ℃。例如，酵母菌傾向于在低于20 ℃的溫度下減慢生長，而在高于35 ℃的溫度下其生命活動(dòng)基本上被抑制。因此，控制培養(yǎng)溫度能夠獲得較高產(chǎn)量的微生物油脂。李楠[17]考查了溫度對微生物的生長和積累油脂的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度較低時(shí)，微生物生長緩慢，生長遲緩期長；隨著環(huán)境溫度的提高，微生物生長速度加快，其生長周期縮短，油脂產(chǎn)量也顯著提高。但是，在35 ℃時(shí)菌種停止生長，說明低溫和高溫均不利于微生物的生長。因此，脂肪酶的活性具有溫度依賴性，酵母菌油脂的產(chǎn)生與培養(yǎng)溫度有關(guān)，這可能源于在較低或較高溫度下參與脂質(zhì)合成酶的部分失活。

2.4 溶氧量及搖床速度

在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，發(fā)酵液中溶氧量的控制主要是通過控制搖床速度來實(shí)現(xiàn)，搖床速度越快，發(fā)酵液中的溶氧量就越大，反之則越小。產(chǎn)油酵母在發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程中需要消耗氧氣，在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速下，發(fā)酵液中氧氣供應(yīng)充足，有利于微生物油脂的積累，當(dāng)搖床速度過快，菌體生長速度過快，耗氧代謝旺盛反而不利于油脂的積累。同時(shí)，過快的速度容易損傷菌體，甚至導(dǎo)致菌體自溶死亡，最終使菌體油脂含量下降。王莉等人[18]研究了搖床速度對菌體產(chǎn)油脂的影響，在轉(zhuǎn)速190 r/min 時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量均達(dá)到最大值，當(dāng)搖床速度過高或過低時(shí)，以上指標(biāo)均會(huì)下降。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間

Ma Y Q 等人[19]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間的長短對油脂積累和脂肪酸的組成起著重要的作用。培養(yǎng)時(shí)間較短時(shí)，菌體主要利用營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖，此時(shí)菌體處于對數(shù)期，生長旺盛，但是油脂未完全形成，菌體積累的油脂量較少；培養(yǎng)時(shí)間過長，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)基本被耗盡，繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致菌體處于饑餓狀態(tài)，此時(shí)菌體為了維持正常的生命活動(dòng)會(huì)消耗自身產(chǎn)生的油脂來獲得能量，菌體處于衰亡期，最終會(huì)死亡而自溶，從而導(dǎo)致油脂產(chǎn)量下降。王斐[1]研究了不同培養(yǎng)時(shí)間對D5-2 菌株油脂的影響，結(jié)果表明，發(fā)酵初期菌體的生物量和油脂含量迅速增長，到了8 d 后，隨著時(shí)間的增加，油脂含量和生物量均呈下降趨勢，說明此時(shí)菌種處于衰亡期。

3 影響產(chǎn)油酵母生產(chǎn)油脂的培養(yǎng)基成分

3.1 碳源

碳源作為酵母菌生長和產(chǎn)脂質(zhì)的重要營養(yǎng)成分，在氮源缺乏的情況下，酵母菌利用碳源代謝合成油脂。常見的碳源有糖類（葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉）、二氧化碳、碳酸鹽、脂類、有機(jī)酸等，考慮到生產(chǎn)成本，目前已經(jīng)探索了許多不同種類的可再生和廉價(jià)碳源用于異養(yǎng)含油微生物的脂質(zhì)生產(chǎn)，包括木質(zhì)纖維素、非谷物糖原料、粗甘油、食品廢水、工業(yè)有機(jī)廢物、甲殼素、菊芋等[18，20]。不同種類的碳源會(huì)影響微生物生長繁殖和油脂合成，不同種類的酵母菌所能利用的碳源也不同。孫登岳[20]添加不同種類碳源到培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)葡萄糖最適宜ZL2-103 菌株發(fā)酵產(chǎn)油脂，相對于葡萄糖來說，木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖及麥芽糖不太適合ZL2-103 發(fā)酵生產(chǎn)油脂。

3.2 氮源

氮源是在菌種生長和油脂合成過程中必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，主要用于構(gòu)成微生物的蛋白質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)等物質(zhì)，常見的氮源包括有機(jī)氮（蛋白胨、酵母提取物、玉米漿、尿素等） 和無機(jī)氮（NH4Cl，NaNO3，NH4NO3等）[21]。有研究表明，無機(jī)氮源比有機(jī)氮源更有益于脂質(zhì)積累，使用的氮源可能通過氮代謝的差異來影響脂質(zhì)的合成[21]。Poli J S 等人[22]評估了由3 種有機(jī)氮源（酵母提取物、胰蛋白胨和尿素） 和2 種無機(jī)氮源（[NH4）2SO4和NH4NO3]組成的5 種氮源促進(jìn)脂質(zhì)積累的能力，也發(fā)現(xiàn)無機(jī)氮比有機(jī)氮更能誘導(dǎo)脂質(zhì)的合成。

3.3 C/N 比

C/N 比也是影響脂質(zhì)生成的重要參數(shù)。研究表明，當(dāng)發(fā)酵液中碳源供應(yīng)充足、氮源不足，或者人為進(jìn)行氮源剝奪的情況下，能夠促進(jìn)微生物脂質(zhì)的積累[23]。一般情況下，高的C/N 有利于脂質(zhì)的積累并促進(jìn)菌體的生長，但較高的C/N 會(huì)導(dǎo)致菌體生物量下降。Lui L P 等人[12]研究了C/N 比范圍在40～140 對L. starkeyi 菌體生長和脂質(zhì)積累的影響，試驗(yàn)通過改變氮源濃度實(shí)現(xiàn)不同的C/N 比，發(fā)現(xiàn)隨著C/N 比從40 增加到60，生物量從16.8 g/L 提高到18.3 g/L，但隨著C/N 比進(jìn)一步增加，生物量逐漸降低，菌體的油脂含量會(huì)不斷增加。研究認(rèn)為，L. starkeyi 的生物量下降可能是由于氮源濃度的降低[12]。這說明氮源供應(yīng)充足時(shí)，有利于細(xì)胞的生長繁殖，氮源缺乏和碳源充足的情況下，碳源會(huì)進(jìn)一步代謝成為油脂并存儲(chǔ)在菌體中。

3.4 無機(jī)鹽

除了有限的氮源外，添加無機(jī)鹽對不同的含油微生物的生長和脂質(zhì)積累有顯著的效果，無機(jī)鹽包括金屬離子，以及S，P，Mg 等微量元素，研究發(fā)現(xiàn)金屬離子能夠參與細(xì)胞膜的構(gòu)成，還會(huì)影響脂肪酶的活性，進(jìn)而影響油脂的積累。向培養(yǎng)基中添加適量無機(jī)鹽能夠調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的pH 值大小和滲透壓，有利于體系中油脂的積累和穩(wěn)定。Chen X F 等人[13]通過添加不同種類的無機(jī)鹽到玉米芯酸水解產(chǎn)物中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加適量無機(jī)鹽能夠顯著刺激菌株T. cutaneum CH002 的生長和油脂的合成。

3.5 前體物質(zhì)

前體物質(zhì)是指微生物油脂在合成過程中所產(chǎn)生的中間物質(zhì)（如輔酶A、甘油、檸檬酸、蘋果酸等），在微生物油脂合成過程中添加這類物質(zhì)，能夠刺激體系中油脂的合成，從而提高油脂的含量[23]。王斐[1]通過響應(yīng)面優(yōu)化法研究了輔酶A、甘油、檸檬酸等前體物質(zhì)對D5-2 菌株產(chǎn)生長及產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果表明，添加前體物質(zhì)能夠顯著提高油脂產(chǎn)量，這些物質(zhì)按一定的比例混合加入，其效果比加入單一的物質(zhì)更顯著。

3.6 生長因子

生長因子是在酵母菌培養(yǎng)中加入到培養(yǎng)基中的物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠影響體系中脂肪酶活性，如乙酸鹽、氨基酸，以及某些維B 類物質(zhì)，可提高油脂的含量。孫登岳[21]通過添加乙酸鹽來實(shí)現(xiàn)對脂質(zhì)代謝調(diào)控，李楠[17]通過添加維B1和維B6來提高油脂的不飽和度。

4 結(jié)語

目前，微生物油脂正廣泛應(yīng)于生物柴油的生產(chǎn)，作為一種生物可再生原料，可以通過微生物利用各種碳源生產(chǎn)得到，也可以通過各種技術(shù)和途徑有效培養(yǎng)和收獲，通過控制pH 值、溫度、溶氧量，或者添加無機(jī)鹽、前體物質(zhì)等能夠增大油脂產(chǎn)量，還能夠進(jìn)一步增大目標(biāo)脂肪酸所占比例。然而，開發(fā)大規(guī)模微生物油脂生產(chǎn)還面臨很多的限制和挑戰(zhàn)。因此，應(yīng)該緊急開發(fā)和設(shè)計(jì)一些解決方案用于未來的工業(yè)化生產(chǎn)，包括廉價(jià)碳源的開發(fā)、含油微生物的篩選和改良、高效細(xì)胞壁破碎的開發(fā)、采油技術(shù)與新型微孔催化劑的開發(fā)和再生技術(shù)等。