趙 君，張大偉，徐劍文，徐海江，劉劍光，朱家輝，吳巧娟，孔 杰，肖松華, 阿里普·艾爾西

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花和油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，新疆 烏魯木齊 830091)

棉花是中國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物，棉花生產(chǎn)在中國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。棉花的病害比較多，特別是黃萎病，給棉花生產(chǎn)造成巨大損失。棉花黃萎病是Carpenter于1914年在美國(guó)弗吉尼亞州發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的，是世界范圍內(nèi)一種破壞性極大的土傳性維管束真菌病害，主要由大麗輪枝菌引起[1]。中國(guó)棉花黃萎病是由于1935年引進(jìn)美國(guó)斯字棉4B棉種傳入中國(guó)的，之后隨著棉種的繁殖和調(diào)運(yùn)，棉花黃萎病在中國(guó)各主要產(chǎn)棉區(qū)逐漸傳播開來(lái)。特別是近幾年，新疆棉區(qū)的黃萎病發(fā)生逐年加重，嚴(yán)重影響中國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

棉花對(duì)黃萎病的抗病機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，涉及多種物質(zhì)和信號(hào)途徑。研究結(jié)果表明，萜醛類化合物、苯丙素類化合物、活性氧、水楊酸、茉莉酸、乙烯、油菜素內(nèi)酯，精胺和Camalexin等信號(hào)途徑參與了棉花對(duì)黃萎病的抗性過程[2-7]。為探究植物對(duì)黃萎病的抗病機(jī)制，大量抗黃萎病相關(guān)的基因被克隆[8]。研究結(jié)果顯示，一些外源基因也能提高棉花對(duì)黃萎病的抗性[9-13]。同時(shí)，許多學(xué)者也開展了抗黃萎病基因分子標(biāo)記定位研究，取得了很大的進(jìn)展。到目前為止，在棉花的26條染色體或連鎖群上共檢測(cè)到至少193個(gè)抗病相關(guān)QTL。部分研究者使用Meta-analysis方法，將已經(jīng)發(fā)表的抗黃萎病相關(guān)QTL進(jìn)行分析，至少篩選獲得28個(gè)QTL簇，檢測(cè)到13個(gè)抗黃萎病QTL熱點(diǎn)區(qū)域，分布在9條染色體上(分別為染色體4、染色體5、染色體7、染色體8、染色體16、染色體19、染色體21、染色體23和染色體26[14])。

許多學(xué)者對(duì)不同棉種進(jìn)行黃萎病抗性鑒定，認(rèn)為多數(shù)海島棉品種對(duì)黃萎病的抗性較強(qiáng)。近20年來(lái)，許多育種學(xué)家嘗試通過回交將海島棉抗黃萎病性狀轉(zhuǎn)育到陸地棉中，但是由于連鎖累贅的影響，進(jìn)展緩慢[14]。陸地棉是世界棉花的主要栽培種，但其遺傳基礎(chǔ)狹窄，缺乏對(duì)多種病蟲害的抗性，僅有少數(shù)品種對(duì)黃萎病的抗性能達(dá)到耐病標(biāo)準(zhǔn)。到目前為止，國(guó)內(nèi)外公開發(fā)放的抗源品種有常抗棉、文 5、豫棉 19、豫棉 21、94-56D、Acala 90、Delcot 344、Siokra15、中G4和中植棉2號(hào)等，對(duì)黃萎病具有較高的抗性[15-16]。利用分子生物學(xué)方法解析這些陸地棉的抗黃萎病機(jī)制，通過回交方法將抗病性狀進(jìn)行轉(zhuǎn)育，能夠顯著加快育種進(jìn)程。

在前期的研究工作中，從泗棉3號(hào)與中植棉2號(hào)雜交后代群體中，通過人工病圃定向篩選獲得1個(gè)抗黃萎病新品系蘇VR018。本研究利用蘇VR018與泗棉3號(hào)構(gòu)建F2群體，定位與抗病相關(guān)的QTL，獲得與抗病連鎖的分子標(biāo)記，為中植棉2號(hào)抗黃萎病基因的精細(xì)定位和抗黃萎病性狀的育種利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2012年，本研究室利用感病親本泗棉3號(hào)與抗病親本中植棉2號(hào)雜交產(chǎn)生F1，同年南繁自交獲得F2。2013年在南京黃萎病人工病圃進(jìn)行抗病鑒定，篩選抗病單株，同年南繁自交，于2014年和2015年連續(xù)2年進(jìn)行自交和抗病鑒定，獲得抗病株系蘇VR018。2015年在黃萎病人工病圃，利用蘇VR018與感病親本泗棉3號(hào)雜交，獲得F1，2015年冬季南繁獲得F2。2016年將包含312個(gè)單株的F2群體種植在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花育種基地，同年，F(xiàn)2單株自交獲得F2∶3家系種子。2016年冬天，于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室用黃萎病菌株V991接種蘇VR018、泗棉3號(hào)、中植棉2號(hào)和F2∶3家系。本研究所用的泗棉3號(hào)來(lái)源于本研究室保存的自交純合種子，中植棉2號(hào)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。

本試驗(yàn)所用棉花落葉型黃萎病菌株V991由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，由本實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)后自行分離提純。

1.2 接種和性狀調(diào)查

25 ℃下，將黃萎病菌涂布于固體土豆培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、瓊脂17 g、蔗糖20 g、蒸餾水1 000 ml)表面，14 d后轉(zhuǎn)移到液體土豆培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、蒸餾水1 000 ml)中，室溫下振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定孢子濃度，將液體稀釋至每1 ml 5×107個(gè)孢子。將處理好的棉花種子播于溫室中的營(yíng)養(yǎng)缽中，1缽2粒，待棉株長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缽撕底，以達(dá)到傷根的目的。用黃萎病病菌的分生孢子懸浮液進(jìn)行接種，每營(yíng)養(yǎng)缽10 ml。接種7 d后將營(yíng)養(yǎng)缽中死苗全部拔除，定期觀察棉苗發(fā)病情況，主要通過考察群體及親本的葉片發(fā)病情況，具體鑒定方法參考Ning等[17]的方法。其中5級(jí)分類的標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。根據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算病情指數(shù)，每個(gè)株系調(diào)查最少15株，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

病情指數(shù)= ∑(各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí))/(調(diào)查總株數(shù)×4)×100%

表1棉花黃萎病葉片病級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)

Table1TheclassificationstandardofVerticilliumwiltcottonleaf

病級(jí) 葉片病害癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)0健株,無(wú)病害癥狀1≤株25%葉片發(fā)病226%～50%葉片發(fā)病或脫落351%～75%葉片發(fā)病或葉片脫落僅剩心葉4≥76%葉片發(fā)病或全病死或脫落成光桿

1.3 DNA分子標(biāo)記

按照 Paterson等[18]的 CTAB 法提取蘇VR018、泗棉3號(hào)和312個(gè)F2單株的 DNA。 根據(jù)已經(jīng)公布的棉花遺傳圖譜，選擇分布在棉花26條染色體上的3 100對(duì)SSR (Simple sequence repeat) 引物檢測(cè)2個(gè)親本基因組之間的多態(tài)性，利用親本間存在多態(tài)的引物對(duì)F2單株進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。所有SSR引物信息均可從 http://www.cottonmarker.org下載得到。 PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物電泳和銀染參照張軍等[19]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析和連鎖圖構(gòu)建

用JoinMap3.0軟件分析標(biāo)記間的連鎖關(guān)系，構(gòu)建分子遺傳圖譜[20]， 連鎖的最低LOD值為2.5，最大遺傳距離為50 cM。采用 Windows QTLs Cartographer 2.0結(jié)合復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite interval mapping，CIM)檢測(cè)抗病性狀的 QTL[21-22]。通過1 000次隨機(jī)抽樣確定LOD閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇VR018主要農(nóng)藝性狀、纖維品質(zhì)及抗病性表現(xiàn)

為更加詳細(xì)地了解蘇VR018的特征，我們比較了蘇VR018、泗棉3號(hào)和中植棉2號(hào)的主要農(nóng)藝性狀、纖維品質(zhì)及抗病性表現(xiàn)。結(jié)果(表2)表明，中植棉2號(hào)與泗棉3號(hào)之間在果枝數(shù)、衣分、纖維整齊度、纖維生產(chǎn)率、纖維比強(qiáng)度以及抗病性方面存在顯著或極顯著差異。在中植棉2號(hào)與泗棉3號(hào)雜交后代中選育的蘇VR018與泗棉3號(hào)相比，其纖維整齊度、纖維比強(qiáng)度以及對(duì)黃萎病的抗性方面得到顯著改良，但是衣分沒有顯著提高(表2)。在蘇VR018的選育過程中，主要目的是將中植棉2號(hào)對(duì)黃萎病的抗性向陸地棉泗棉3號(hào)轉(zhuǎn)育，因此蘇VR018的抗病性得到極顯著提高。該結(jié)果表明，通過系統(tǒng)選育成功地將中植棉2號(hào)的部分抗病相關(guān)位點(diǎn)轉(zhuǎn)育到新品系蘇VR018中。蘇VR018與親本泗棉3號(hào)在抗病性狀方面有較大的遺傳差異，適合進(jìn)行抗病性狀的分子標(biāo)記。

表2蘇VR018、泗棉3號(hào)和中植棉2號(hào)主要農(nóng)藝性狀、纖維品質(zhì)及抗病性平均表現(xiàn)值

Table2Averageperformancevaluesofagronomiccharacters,fiberqualityandresistancetoVerticilliumwiltofSuVR018,Simian3andZhongzhimian2

性狀 泗棉3號(hào)蘇VR018中植棉2號(hào)株高(cm)98.397.1103.0果枝數(shù) 16.516.414.8*鈴數(shù) 18.717.816.1單鈴質(zhì)量(g) 5.15.25.9衣分(%)43.239.2*39.4*纖維長(zhǎng)度(mm)30.430.129.3整齊度(%)75.884.2*84.7*馬克隆值4.94.94.7生長(zhǎng)率(%)7.66.96.6*比強(qiáng)度(cN/tex)23.529.1**29.2**病情指數(shù) (%)56.728.3**20.8**

*表示與泗棉3號(hào)相比差異顯著(P<0.05)；**表示與泗棉3號(hào)相比差異極顯著(P<0.01)。

2.2 F2∶3群體病情指數(shù)

對(duì)親本及其F2∶3群體進(jìn)行抗病鑒定，結(jié)果表明2個(gè)親本的抗病性存在顯著差異。對(duì)F2∶3群體抗病鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，顯示F2∶3株系中病情指數(shù)的最大值為71.1%，最小值為3.7%，中親值為41.2%，病情指數(shù)平均值為36.1%，偏度系數(shù)為0.12， 峰度系數(shù)為0.60，廣義遺傳力分別為0.7。另外，F(xiàn)2∶3群體病情指數(shù)表現(xiàn)為單峰連續(xù)分布，沒有明顯的比例關(guān)系，表現(xiàn)出數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)(圖 1)。因此我們認(rèn)為蘇VR018對(duì)棉花黃萎病的抗性屬于多基因控制，適于進(jìn)行QTL定位。

圖1 F2∶3群體病情指數(shù)頻率分布圖Fig.1 Frequency distributions of disease index in F2∶3 population

2.3 蘇VR018遺傳背景分析及連鎖圖構(gòu)建

利用3 100對(duì)SSR引物，對(duì)泗棉3號(hào)和蘇VR018進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選到多態(tài)性標(biāo)記32個(gè)，分布在18條染色體上，多態(tài)率為10.3%。用在雙親之間存在多態(tài)性的SSR引物對(duì)312個(gè)F2單株進(jìn)行分析，共得到32個(gè)位點(diǎn)，經(jīng)卡方檢測(cè)有3個(gè)位點(diǎn)偏分離，在構(gòu)建連鎖圖時(shí)剔除這些偏分離的位點(diǎn)。

用Joinmap 3.0軟件構(gòu)建連鎖群(LOD≥3.0)。最終得到1個(gè)包含17個(gè)位點(diǎn)和6個(gè)連鎖群的連鎖圖譜(圖2)。構(gòu)建的連鎖群長(zhǎng)度18.30～44.70 cM，圖譜總長(zhǎng)198.00 cM，標(biāo)記間平均遺傳距離為10.42 cM，每個(gè)連鎖群標(biāo)記數(shù)為2～4 個(gè)。根據(jù)棉花微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫(kù)提供的信息對(duì)連鎖群中SSR 標(biāo)記進(jìn)行染色體定位，6個(gè)連鎖群被分別定位在 染色體5(染色體A5)、染色體12(染色體A12)、染色體17(染色體D3)、染色體19(染色體D5)、染色體22(染色體D4)和染色體25(染色體D6)上。

圖2 棉花抗黃萎病QTL定位Fig.2 QTL mapping of cotton resistance to Verticillium wilt (VW)

2.4 棉花抗黃萎病QTL 檢測(cè)

用Windows QTL Cartographer 2.5 軟件，通過復(fù)合區(qū)間作圖法分析F2∶3家系的抗黃萎病QTL，通過1 000 次隨機(jī)抽樣確定LOD閾值為2.5。利用F2∶3家系接種落葉型黃萎病菌V991后調(diào)查獲得的病情指數(shù)，共檢測(cè)到4個(gè)與棉花抗黃萎病相關(guān)的QTL (表3)。分別位于染色體5(染色體A5)、染色體19(染色體D5)、染色體19(染色體D5)和染色體25(染色體D6)染色體上，位于標(biāo)記HAU883-NAU3212、MGHES40-MUSS138、MUSS138-DPL209和NAU3171-CIR181之間，LOD值分別為4.12、2.67、4.20和3.81，分別命名為qVW-V991-1、qVW-V991-2、qVW-V991-3和qVW-V991-4。 這4個(gè)QTL 加性效應(yīng)分別為-0.041 4、0.034 1、0.031 2和-0.030 5。顯性效應(yīng)分別為0.089 2、0.137 0、0.037 4和0.194 0。表型貢獻(xiàn)率分別為6.41%、3.78%、4.61% 和5.76%，4個(gè)QTL共解釋20.56%的表型變異。

表3利用復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)檢測(cè)到的與抗黃萎病相關(guān)的QTL

Table3QTLanalysesforVWresistancedetectedbycompositeintervalmapping

QTL名稱染色體位置 (cM) 兩側(cè)標(biāo)記LOD值加性效應(yīng)顯性效應(yīng)貢獻(xiàn)值(%)qVW-V991-1A536.50HAU883-NAU32124.12-0.041 40.089 26.41qVW-V991-2D50.01MGHES40-MUSS1382.670.034 10.137 03.78qVW-V991-3D518.90MUSS138-DPL2094.200.031 20.037 44.61qVW-V991-4D65.01NAU3171-CIR1813.81-0.030 50.194 05.76

本研究還利用TASSEL 2.1軟件[23]的一般線性模型(General linear model，GLM)程序，將32個(gè)位點(diǎn)的等位變異分別與抗病性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，采用一般線性模型檢測(cè)到與棉花抗黃萎病顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)5個(gè)，分別為位于染色體5(染色體A5)上的標(biāo)記NAU3212， 染色體19(染色體D5)上的標(biāo)記MGHES40和DPL209，染色體25(染色體D6)上的標(biāo)記CIR181，另外1個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)為沒有進(jìn)入連鎖群的標(biāo)記NAU5204。5個(gè)位點(diǎn)表型變異解釋率分別為6.38%, 1.50%, 2.80%, 2.10% 和2.20%，5個(gè)位點(diǎn)共解釋14.98%的表型變異(表4)。

表4與黃萎病抗性顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)及其對(duì)表型變異的解釋率

Table4MarkerlociassociatedwithresistancetoVWandtheinterpretationrateforphenotypicvariation

標(biāo)記染色體p-GLMr2-GLMNAU3212A50.000 070.063 8MGHES40D50.039 150.015 0NAU5204A120.017 600.028 0CIR181D60.015 700.021 0DPL209D50.006 930.022 0

p-GLM為一般線性模型(GLM)p值，r2-GLM為解釋表型變異率。

3 討 論

棉花黃萎病是中國(guó)棉花生產(chǎn)的主要限制因素，棉花育種專家在棉花抗黃萎病育種和抗黃萎病分子機(jī)制解析方面做了大量工作，取得了一定進(jìn)展，但是由于缺乏對(duì)黃萎病高抗或免疫的陸地棉栽培品種，研究進(jìn)展緩慢。在中國(guó)棉花抗黃萎病育種中中植棉2號(hào)常被作為抗源，同時(shí)，一些研究者也對(duì)中植棉2號(hào)的抗黃萎病機(jī)制進(jìn)行了研究。祁偉彥等[24]研究結(jié)果顯示，中植棉2號(hào)黃萎病抗性與SSR標(biāo)記NAU1269、NAU828和NAU1225連鎖，利用標(biāo)記NAU1269、NAU828和NAU1225的序列，在棉花全基因組中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，標(biāo)記NAU1269、NAU828和NAU1225分別位于棉花基因組的A5(13830896), D5(13669157)和D5(13669176)染色體上。本研究定位的4個(gè)QTL中的3個(gè)位于染色體A5和D5上，通過比對(duì)定位在A5和D5上的3個(gè)QTL連鎖標(biāo)記序列發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記CIR139(D5:13516109)、MGHES40(D5:20109590)和NAU3212(A5:11483877)在基因組中位置與標(biāo)記NAU1269、NAU828和NAU1225位置相鄰(括號(hào)中數(shù)字代表正向引物在染色體中的位置)。這初步表明本研究定位的3個(gè)位于染色體A5和D5上與抗黃萎病相關(guān)的QTL可能與祁偉彥等[24]研究的是相同的位點(diǎn)。張華崇等[25]以感病品種861為父本、中植棉2號(hào)為母本配制雜交組合，構(gòu)建6個(gè)世代群體，并在田間病圃進(jìn)行抗病性鑒定，利用主基因-多基因混合遺傳模型的多世代聯(lián)合分析法對(duì)中植棉2號(hào)的抗病性進(jìn)行分析。張華崇等[25]研究結(jié)果表明，中植棉2號(hào)抗性遺傳符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因遺傳模型，F(xiàn)2的主基因遺傳率達(dá)到82.09%。本研究在中植棉2號(hào)和泗棉3號(hào)的雜交F2群體中選育的抗病株系蘇VR018，其遺傳背景與泗棉3號(hào)相近，是解析中植棉2號(hào)抗病性的理想材料。比較蘇VR018、中植棉2號(hào)和泗棉3號(hào)的農(nóng)藝性狀和抗病性，結(jié)果顯示蘇VR018病情指數(shù)與中植棉2號(hào)相比存在顯著差異，但相比于泗棉3號(hào)，抗病性得到極顯著提高。這也暗示中植棉2號(hào)抗病性的遺傳率比較高，2對(duì)抗病主基因可能轉(zhuǎn)育到了抗病株系蘇VR018中。通過與中植棉2號(hào)雜交，可以在低世代中選育出抗黃萎病新品系。

關(guān)于棉花抗黃萎病基因QTL的定位已有報(bào)道，但是陸地棉的抗黃萎病QTL定位報(bào)道不多，這與陸地棉遺傳基礎(chǔ)狹窄，遺傳圖譜標(biāo)記密度不足有關(guān)[14,17,26-29]。本研究利用3 100對(duì)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖圖構(gòu)建，只獲得32對(duì)具有多態(tài)性的標(biāo)記，多態(tài)率只有10.3%，這與陸地棉遺傳基礎(chǔ)狹窄，標(biāo)記多態(tài)率低有關(guān)，但是更重要的原因是本研究使用的抗病親本蘇VR018是從感病親本泗棉3號(hào)與中植棉2號(hào)雜交后代中選育的新品系，其遺傳背景與泗棉3號(hào)非常相似，這進(jìn)一步導(dǎo)致其與泗棉3號(hào)之間標(biāo)記多態(tài)率降低。4個(gè)QTL解釋20.56%的表型變異，利用單標(biāo)記分析檢測(cè)到的5個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，解釋表型變異也只有14.98%。我們推測(cè)可能的原因有2點(diǎn)，一是本研究構(gòu)建的遺傳圖譜覆蓋率低，沒有完全覆蓋蘇VR018攜帶的黃萎病抗性位點(diǎn)，導(dǎo)致蘇VR018中其他的抗病位點(diǎn)沒有檢測(cè)到；二是蘇VR018中黃萎病抗性位點(diǎn)具有病菌?；匦?，其他的抗黃萎病位點(diǎn)對(duì)黃萎病菌V991沒有抗性。因此，通過繼續(xù)增加標(biāo)記密度和標(biāo)記類型來(lái)解析蘇VR018的抗病位點(diǎn)將是下一步工作的重點(diǎn)。

本研究在D6染色體上檢測(cè)到的QTL可能是一個(gè)新的抗黃萎病位點(diǎn)。Zhang等[12]分析了目前已經(jīng)公布的棉花抗黃萎病QTL，結(jié)果顯示在A6染色體上存在至少8個(gè)抗病相關(guān)的QTL，而D6染色體上只存在2個(gè)抗黃萎病相關(guān)QTL。這有2個(gè)方面原因，一是D6染色體上存在的抗黃萎病QTL確實(shí)少，另一個(gè)原因是由于使用不同的棉花品種和黃萎病菌株，D6染色體上的QTL沒有檢測(cè)到。本研究定位在D6染色體上的抗病位點(diǎn)連鎖標(biāo)記NAU3171與已經(jīng)公布的D6染色體上的QTL聯(lián)鎖標(biāo)記BNL3436在D6染色體上遺傳距離較遠(yuǎn)，初步判斷可能不是同一個(gè)抗病位點(diǎn)。該位點(diǎn)在今后研究中需重點(diǎn)關(guān)注。