管俊嬌，楊曉洪，王江民，張 鵬，黃清梅，白 潔，余志慧，張建華

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，云南 昆明 650223；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205)

得天獨(dú)厚的自然環(huán)境造就了云南省豐富的稻種資源，同時(shí)多樣的民族文化又不斷促進(jìn)稻種資源的豐富和發(fā)展，使云南省成為中國(guó)栽培稻的遺傳多樣性中心[1-2]。利用豐富的水稻資源選育出了大量?jī)?yōu)良品種，其中以高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗倒伏為特點(diǎn)的云粳系列新品種在云南省及周邊省份得到了大面積推廣應(yīng)用。但隨著品種數(shù)量的增多和頻繁的種質(zhì)交流，種子市場(chǎng)中的“多、亂、雜”現(xiàn)象和“品種同質(zhì)化”現(xiàn)象并存，制假、售假事件時(shí)有發(fā)生，使國(guó)家和農(nóng)民利益受到很大的損害，給品種管理和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)帶來(lái)諸多困難。因此，快速、準(zhǔn)確地鑒別品種顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的品種鑒定方法為田間種植鑒定，主要依據(jù)形態(tài)學(xué)性狀對(duì)品種進(jìn)行鑒別區(qū)分。DNA分子標(biāo)記技術(shù)由于不受環(huán)境條件的影響，可從分子水平上對(duì)品種的遺傳特異性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地鑒定，克服了傳統(tǒng)形態(tài)標(biāo)記鑒定周期長(zhǎng)、誤差大、性狀差異小的缺點(diǎn)[3-6]。其中SSR標(biāo)記因具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳和易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[7]，被植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)生物化學(xué)和分子技術(shù)工作組用作植物新品種保護(hù)最廣泛應(yīng)用的標(biāo)記體系，也被廣泛用于作物多樣性分析及構(gòu)建指紋圖譜[8]。

作物分子身份證是品種特異識(shí)別的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，以分子標(biāo)記的多態(tài)性檢測(cè)手段為基礎(chǔ)，將 DNA 指紋進(jìn)行數(shù)字化編碼賦值[9]，利用最簡(jiǎn)引物組合實(shí)現(xiàn)作物種質(zhì)資源最大程度區(qū)分[10]。自2007年起陸續(xù)開(kāi)展了大豆[11-13]、桃[14]、高粱[15]、甘藍(lán)型油菜[16]、梨[17]、蘿卜[18]、葡萄[19]、蘋(píng)果[20]等作物分子身份證的研究工作。在水稻方面，陸徐忠等[21]、顏靜宛等[22]利用 SSR 標(biāo)記分別構(gòu)建了水稻雜交種或親本材料的分子身份證，這些研究對(duì)水稻品種資源評(píng)價(jià)、利用和保護(hù)等起到了重要作用。但是對(duì)于遺傳背景較相似的一系列品種的分子身份證構(gòu)建還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的35份云粳系列水稻品種為研究材料，采用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)和熒光測(cè)序技術(shù)建立云南省粳稻品種指紋圖譜，篩選最佳引物組合，構(gòu)建35份云粳系列水稻品種的分子身份證，以期用最簡(jiǎn)引物組合實(shí)現(xiàn)品種的最大程度區(qū)分，減少繁復(fù)的工作量和高昂的檢測(cè)成本，為云粳系列水稻品種的快速識(shí)別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取云南省7個(gè)育種單位近年來(lái)育成的163份粳稻品種、品系作為試驗(yàn)材料，其中包括35份云粳系列水稻品種。

1.2 DNA的提取

每份試驗(yàn)材料取100 粒種子，經(jīng)催芽播種于苗床上，在塑料大棚內(nèi)進(jìn)行育苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)到四葉一心時(shí)，混合取20個(gè)單株的葉片，用改良的CTAB法[18]提取DNA。

1.3 SSR標(biāo)記檢測(cè)

依據(jù)國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[23-24]公布的水稻微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，經(jīng)過(guò)初篩選，在每條染色體上均勻選擇1～3對(duì)，共30對(duì)SSR熒光標(biāo)記引物用于遺傳多樣性檢測(cè)。PCR總反應(yīng)體系為10 μl，采用2×Mix混合液，10.0 μl的反應(yīng)體積包括5.0 μl 2×Mix混合液、0.6 μl 5 μmol/L正向引物、0.6 μl 5 μmol/L反向引物、1.0 μl樣品DNA、2.8 μl超純水。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管熒光電泳系統(tǒng)AB 3730XL DNA 分析儀(Applied Biosystems，USA)上檢測(cè)。用GeneMapper Ver.3.7(Applied Biosystems，USA)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和校正，讀出每個(gè)位點(diǎn)每個(gè)樣品的等位變異片段大小數(shù)據(jù)。

1.4 品種分子身份證的構(gòu)建

用POWERMARKER Version3.25軟件分析供試材料指紋圖譜數(shù)據(jù)，獲得引物多態(tài)性，并按非加權(quán)配對(duì)法(UPGMA)采用Nei’s遺傳距離進(jìn)行聚類分析。篩選出鑒別云粳系列水稻品種的核心引物，讀取云粳系列水稻品種的核心SSR熒光標(biāo)記的指紋數(shù)據(jù)，并對(duì)指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字化編碼。再結(jié)合品種的基本信息利用二維碼生成軟件將編碼字符串轉(zhuǎn)化成每份材料獨(dú)特的條碼標(biāo)識(shí)即分子身份證。

2 結(jié) 果

2.1 云南省粳稻品種SSR標(biāo)記多態(tài)性

用30對(duì)SSR引物，對(duì)163份粳稻品種進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果(表1)表明，30個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)共檢測(cè)到等位基因207個(gè)，每對(duì)引物等位基因變幅為2～17，平均等位基因數(shù)為6.6。基因多樣性指數(shù)變異范圍為 0.024 4～0.823 9，平均為0.479 8；多態(tài)信息含量(PIC)的變異范圍為 0.02～0.80，平均為0.44。其中，在RM8277、RM336、RM72、RM297和RM219等位點(diǎn)所檢測(cè)到的多態(tài)信息指數(shù)較大。

表1云南省粳稻品種SSR標(biāo)記遺傳多樣性參數(shù)

Table1ThegeneticdiversityparametervaluesofSSRmarkersinjaponicaricevarietiesfromYunnanprovince

位點(diǎn) 染色體等位基因數(shù)基因多樣性指數(shù)多態(tài)信息含量(PIC)RM583160.510.46RM208250.710.65RM8277390.800.77RM471450.630.58RM274520.020.02RM190670.590.51RM3367140.820.80RM728120.740.71RM278950.150.15RM2581040.100.09RM2241150.460.39RM191260.140.14RM1160.700.65RM423260.620.56RM85330.460.39RM5514100.720.68RM267570.520.41RM253660.540.44RM432750.630.56RM331850.090.09RM219960.730.69RM3111040.210.19RM2091170.510.48RM171240.590.51RM13067130.710.67OSR28970.530.49RM2971170.750.73RM2221080.330.31RM2541180.700.65RM71021250.480.42

分子身份證的構(gòu)建既要滿足唯一性和可識(shí)別(鑒別)性，又要滿足最簡(jiǎn)引物組合的要求，否則將會(huì)造成構(gòu)建的分子身份證過(guò)于冗繁。因此，有必要單獨(dú)對(duì)云粳系列水稻品種的指紋圖譜進(jìn)行分析，篩選可以區(qū)分供試品種的最簡(jiǎn)引物組合。云粳系列水稻品種SSR標(biāo)記多態(tài)性分析結(jié)果(表2)顯示，30對(duì)SSR引物在35份材料中共檢測(cè)到等位基因133個(gè)，每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)為1～9個(gè)，平均為4個(gè)?；蚨鄻有灾笖?shù)變異范圍為0～0.74，平均為0.40；多態(tài)信息含量(PIC)的變異范圍為 0～0.72，平均為0.36。在RM8277、RM336、RM1、RM551 、RM219 、RM1306和RM254等位點(diǎn)所檢測(cè)到的遺傳多樣性參數(shù)值較大。對(duì)比表1和表2可知，對(duì)于不同的群體，引物的多態(tài)信息含量指數(shù)差異較大。

表2云粳系列水稻品種SSR標(biāo)記遺傳多樣性參數(shù)

Table2ThegeneticdiversityparametervaluesofSSRmarkersinjaponicaricevarietiesofYunjingseries

位點(diǎn) 染色體等位基因數(shù)基因多樣性指數(shù)多態(tài)信息含量(PIC)RM583160.280.27RM208240.420.38RM8277380.720.69RM471440.550.48RM274510.000.00RM190640.590.50RM336790.740.72RM72850.560.48RM278920.110.10RM2581030.110.11RM2241120.490.37RM191230.180.18RM1160.620.55RM423230.540.46RM85320.410.32RM551480.640.60RM267540.420.36RM253640.540.44RM432750.530.49RM331810.000.00RM219960.650.60RM3111020.060.06RM2091150.370.33RM171240.230.22RM1306790.670.64OSR28950.560.50RM297160.480.46RM2221040.460.40RM2541150.690.65RM71021230.470.40

2.2 鑒別云粳系列水稻品種的最佳引物組合

用 1 對(duì) SSR 引物難以將全部云粳系列水稻品種分開(kāi)，因此選取多態(tài)性信息含量較高的引物(RM8277、RM336、RM551 、RM219 、RM254、RM1)6對(duì)兩兩組合，分析其對(duì)云粳系列水稻品種的區(qū)分率。RM336和RM551引物組合分辨率最高，可以區(qū)分17個(gè)品種；其次是RM551 和RM1引物組合，可以區(qū)分 16個(gè)品種；再次是 RM336和RM219引物組合，可以區(qū)分 15個(gè)品種。根據(jù) 2 對(duì)引物組合的區(qū)分結(jié)果，繼續(xù)增加引物組合的數(shù)量。在增加到 5 對(duì)引物時(shí)，可將全部云粳系列水稻品種區(qū)分開(kāi)來(lái)，5 對(duì)引物為 RM8277、RM336、RM551、RM254、RM1。用以上5對(duì)引物對(duì)供試的163個(gè)云南粳稻品種進(jìn)行分析，該組引物能把云粳系列品種與其他粳稻品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。于是利用這 5 對(duì)引物構(gòu)建云粳系列品種的分子身份證，既滿足唯一性和可識(shí)別(鑒別)性，又滿足了最簡(jiǎn)引物組合的要求。

2.3 云粳系列水稻品種分子身份證編碼

利用可將全部供試云粳系列水稻品種區(qū)分的 5 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建分子指紋圖譜，圖1為云粳39號(hào)在5個(gè) SSR 位點(diǎn)的分子指紋圖譜。讀取 35份水稻品種的5個(gè) SSR 熒光標(biāo)記的指紋數(shù)據(jù)，按標(biāo)記所在染色體由小到大排序，即按照RM1、RM8277、RM551、RM336、RM254的順序依次排列。例如，云粳39號(hào)的擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管熒光電泳系統(tǒng)檢測(cè)得到的片段大小(bp)為82/84、215/215、171/193、154/154、142/142(水稻為二倍體, SSR 擴(kuò)增只有 1 條主帶時(shí)，須重復(fù)記錄一次)。隨著條碼技術(shù)的發(fā)展，尤其是二維碼的出現(xiàn)，條碼可容納的數(shù)據(jù)量增加，因此直接用按順序排列的片段大小作為品種的分子指紋信息(表3)。 再加上水稻品種的基本商品信息, 包括作物種類、品種植物學(xué)類型、品種繁殖類型、品種名稱、生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者名稱、審定區(qū)域和審定的年份。最后利用二維碼技術(shù)將每份材料的按相同順序排列的字符串轉(zhuǎn)化成每份材料獨(dú)特的二維碼標(biāo)識(shí)即分子身份證。例如：云粳39號(hào)的二維碼分子身份證見(jiàn)圖2，掃碼后內(nèi)容如圖3。

圖1 云粳39號(hào)水稻的5個(gè)SSR分子標(biāo)記指紋圖譜Fig.1 The SSR fingerprinting of rice Yunjing 39 at five SSR loci

3 討 論

3.1 分子身份證核心引物的選擇

分子身份證的構(gòu)建既要滿足唯一性和可識(shí)別(鑒別)性，同時(shí)要滿足最簡(jiǎn)引物組合的要求，以免造成構(gòu)建的分子身份證冗余。引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)、基因型數(shù)越多，PIC值越高，表明其區(qū)分品種的能力也越強(qiáng)，在分子身份證構(gòu)建中具有的價(jià)值也越高[14]。SSR引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)與所用材料的遺傳背景有關(guān)，對(duì)于不同遺傳背景的群體，引物的多態(tài)信息含量指數(shù)差異較大，即引物區(qū)分品種的能力差異較大。因此，本研究單獨(dú)對(duì)云粳系列水稻品種的指紋圖譜進(jìn)行分析，篩選可以區(qū)分供試品種的最簡(jiǎn)引物組合。篩選的 5 對(duì)核心引物組合可以把來(lái)自同一育種單位、遺傳背景較近的云粳系列水稻品種有效區(qū)分，而且能把云粳系列品種與云南省目前主要粳稻品種區(qū)別開(kāi)來(lái)，說(shuō)明用這5對(duì)引物構(gòu)建云粳系列品種分子身份證既保證了身份證的唯一性，又達(dá)到了以最少標(biāo)記區(qū)分品種的目的，減少了指紋分析的工作量，可作為快速鑒別水稻品種的一種有效方法。

表335個(gè)云粳系列水稻品種分子指紋信息

Table3Themolecularfingerprintinginformationof35japonicaricevarietiesofYunjingseries

編號(hào)品種名稱分子指紋(bp)1云粳9號(hào)82/82、196/196、191/191、141/141、169/1692云粳136號(hào)70/72、172/172、193/193、141/141、169/1693云粳1號(hào)82/84、196/196、193/193、141/141、171/1714云粳2號(hào)82/86、215/215、193/193、138/138、163/1635云粳3號(hào)79/82、212/212、193/193、157/160、171/1716云粳4號(hào)82/84、212/212、181/193、166/166、135/1357云粳5號(hào)82/84、215/215、191/191、151/154、135/1358云粳6號(hào)82/84、215/215、193/193、151/154、142/1429云粳7號(hào)82/84、215/215、193/193、138/141、163/16310云粳10號(hào)82/84、215/215、191/191、166/166、135/13511云粳12號(hào)82/84、212/212、193/193、166/166、135/13512云粳14號(hào)72/86、212/212、193/193、138/138、135/13513云粳15號(hào)82/84、212/212、193/193、163/166、135/13514云粳16號(hào)82/84、184/184、193/193、172/172、169/16915云粳17號(hào)82/84、212/212、193/193、163/166、163/16316云粳18號(hào)84/84、215/215、193/193、166/166、135/13517云粳19號(hào)84/84、190/212、193/193、166/166、135/13518云粳20號(hào)82/84、212/212、193/193、166/166、142/14219云粳21號(hào)84/84、212/212、193/193、166/166、135/13520云粳優(yōu)1號(hào)84/86、199/199、191/191、141/141、142/14221云粳優(yōu)5號(hào)82/84、199/199、191/191、163/166、142/14222云粳優(yōu)8號(hào)82/84、212/212、195/195、166/166、142/14223云粳優(yōu)9號(hào)82/84、212/212、195/195、163/166、142/14224云粳優(yōu)10號(hào)84/84、212/212、191/191、166/166、135/13525云粳優(yōu)15號(hào)82/84、212/212、193/193、163/166、142/14226云粳8號(hào)86/86、205/215、187/193、141/141、163/16327云粳25號(hào)84/84、212/212、187/191、166/166、142/14228云粳26號(hào)84/84、212/212、187/193、166/166、142/14229云粳29號(hào)82/82、215/215、187/191、154/154、135/13530云粳31號(hào)82/84、172/172、187/193、166/166、135/13531云粳32號(hào)82/84、212/212、187/193、138/138、135/13532云粳34號(hào)82/84、199/199、189/197、163/166、135/13533云粳36號(hào)79/82、190/205、189/197、166/166、135/13534云粳37號(hào)82/84、199/199、189/193、154/154、142/14235云粳39號(hào)82/84、215/215、171/193、154/154、142/142

圖2 云粳39號(hào)的二維碼分子身份證Fig.2 The molecular identity card of rice Yunjing 39

圖3 云粳39號(hào)的分子身份證內(nèi)容Fig.3 The contents of the molecular identity card of rice Yunjing 39

3.2 分子身份證的編碼

目前構(gòu)建分子身份證的編碼方法主要有 3 類[9]，都是以給基因位點(diǎn)擴(kuò)增 DNA 條帶賦值為基礎(chǔ)，按一定順序進(jìn)行編碼，串聯(lián)起來(lái)形成一組數(shù)據(jù)。不管研究者選擇哪種編碼方法，最終都要通過(guò)條碼技術(shù)將其轉(zhuǎn)換為可用機(jī)器識(shí)別的條碼或二維碼，才可利用掃描器進(jìn)行掃描實(shí)現(xiàn)快速識(shí)別品種，擺脫人工讀取字符串式分子身份證的麻煩。隨著二維碼技術(shù)的發(fā)展，一個(gè)二維碼可容納的數(shù)據(jù)大幅增加，加之熒光測(cè)序技術(shù)在SSR技術(shù)中的應(yīng)用，SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)熒光測(cè)序的檢測(cè)體系可以直接得出不同等位基因的片段大小[25-26]。本研究中直接用按序排列等位基因片段大小作為某一品種的分子身份標(biāo)識(shí)，再加上該品種的基本商品信息，構(gòu)成了此品種的分子身份證，使得使用者可直接獲得不同品種之間分子差異，也省去了在有新等位基因出現(xiàn)時(shí)重新對(duì)帶型編碼的麻煩。

3.3 分子身份證的用途

分子身份證與指紋圖譜的功能相同，但分子身份證原則上是以最少特異變異位點(diǎn)或標(biāo)記為基礎(chǔ)，提取每份種質(zhì)特異的遺傳信息，并通過(guò)數(shù)字化處理和軟件分析建立分辨不同種質(zhì)的字符串形式，以達(dá)到簡(jiǎn)單明了地區(qū)分品種間差異，在品種檢索時(shí)更直觀的目的[14]。本研究構(gòu)建的品種分子身份證可以通過(guò)制作標(biāo)簽，標(biāo)識(shí)于商品種子包裝上，直接用于優(yōu)良品種種子的防偽和溯源，使用者可用讀碼器獲得品種信息。分子身份證對(duì)水稻品種識(shí)別鑒定,品種標(biāo)識(shí),假冒偽劣品種鑒定,品種推廣等具有重要的意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。