■崔青曼 吳佩佩 張 旭 蔡凡帆 袁春營

（天津市海洋環(huán)境保護(hù)與修復(fù)技術(shù)工程中心天津市海洋資源與化學(xué)重點試驗室天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津300457）

南美白對蝦（Litopenaeus vannamei），俗稱白肢蝦，屬于節(jié)肢動物門(Arthopoda)、甲殼綱(Crustacean)、十足目(Decapoda)、游泳亞目(Natantia)、對蝦科(Penacidae)、對蝦屬(Penaeus)，Litopenaeus亞屬，為廣溫廣鹽性熱帶蝦類，是世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一。1988年，中國科學(xué)院海洋研究所從美國夏威夷引進(jìn)中國，早已在全國廣泛養(yǎng)殖。但是最近幾年來，對蝦病害頻發(fā)，對蝦養(yǎng)殖成功率明顯降低，給養(yǎng)殖戶造成較大經(jīng)濟(jì)損失。由于抗生素之類的藥物已受到嚴(yán)格控制，國內(nèi)外學(xué)者和養(yǎng)殖戶把目光聚焦在免疫增強(qiáng)劑上，希望通過提高對蝦機(jī)體免疫力，增強(qiáng)對蝦抵抗病害和應(yīng)激的能力，提升對蝦養(yǎng)殖成功率和養(yǎng)殖水平[1-5]。

小球藻為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，是地球上最早的生命之一，適應(yīng)能力強(qiáng)，分布廣，生長速度快，生物量大[6]，其蛋白質(zhì)含量高（50%以上），被作為優(yōu)良的蛋白質(zhì)來源[7]。小球藻還含有脂類、碳水化合物、多糖和葉綠素等多種營養(yǎng)成分，是營養(yǎng)全面的食品[8]，小球藻所特有的促生長因子能促進(jìn)生物的生長，提高生產(chǎn)性能，增加機(jī)體免疫力，降低飼料消耗，小球藻細(xì)胞中含有的“酸性多糖體”可誘使生物體產(chǎn)生大量的干擾素，干擾素會刺激機(jī)體免疫功能，大大增強(qiáng)抗病能力[9]。用小球藻作為飼料添加劑，在鯽魚、三疣梭子蟹水產(chǎn)動物上取得良好效果[10-11]。何亞丁等[12]研究了小球藻藻渣替代豆粕對凡納濱對蝦生長性能和氮磷排放的影響，小球藻藻渣可以部分替代凡納濱對蝦飼料中的豆粕，當(dāng)其用量為11%時，可使豆粕的用量從19%降至10%而不影響凡納濱對蝦的生長和氮排放，并降低磷排放。本文在飼料中添加小球藻，通過測定系列指標(biāo)，探討其對對蝦生長及免疫功能的影響，為實現(xiàn)南美白對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小球藻購自上海光語生物科技有限公司。試驗用南美白對蝦購自天津鑫永豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體長（6.14±1.39）cm，體質(zhì)量為(4.26±1.71)g。副溶血弧菌為天津市病害防治中心友好贈送。超氧化物歧化酶（SOD）、酚氧化酶（PO）、一氧化氮合酶（NOS）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

試驗飼料為自行配制，基礎(chǔ)配方見表1。飼料原料經(jīng)粉碎后過80目篩，各原料按配比定量后混合均勻，然后加入適量的水揉勻，經(jīng)雙螺桿擠條機(jī)擠壓出直徑為1.0 mm粒徑的飼料，60℃烘干后剪切成1.5 mm長的顆粒貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置3個小球藻組，添加劑量分別為0.5%、1%和2%小球藻分別替代基礎(chǔ)飼料中的國產(chǎn)魚粉，1個對照組，每組設(shè)3個平行，共計12個處理組。水族箱規(guī)格720 mm×490 mm×380 mm，每個水族箱中投放40只對蝦。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

整個飼養(yǎng)試驗持續(xù)4周，投餌量按照對蝦體重的4%～6%進(jìn)行投喂，每天投喂4次，投喂時間：6:00、11:00、16:00和21:00，各時間點投喂量占日總投餌量的比值分別為30%、20%、30%和20%。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫27～29 ℃，鹽度18～20，pH值7.8～8.1，溶解氧＞6 mg/l。

表1 飼料基礎(chǔ)配方

1.2.3 對蝦生物學(xué)指標(biāo)測定

4周養(yǎng)殖試驗結(jié)束，分別對每個處理組對蝦進(jìn)行計數(shù)、稱重，計算對蝦的存活率及特定生長率。

存活率(%)=Nt/No×100

特定生長率（%/d，SGR)=100×(LnMt-LnMo)/t

式中：No、Nt——分別為每個重復(fù)對蝦初始尾數(shù)和終末尾數(shù)(只)；

Mo、Mt——分別為初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量(g)；

t——試驗天數(shù)(d)。

1.2.4 對蝦非特異性免疫指標(biāo)測定

1.2.4.1 血清的制備

用l ml的無菌注射器，從每個處理組中隨機(jī)取出15～20只蝦，腹竇部位取血，置于離心管中，4℃條件下，3 500 r/min離心10 min，上清液即為南美白對蝦血清，用于指標(biāo)測定。

1.2.4.2 肝胰腺組織勻漿的制備

將抽取血液后的對蝦解剖，取出肝胰腺，置于5 ml離心管中，冰浴條件下，加入9倍體積0.05 mol/l、pH值6.5的磷酸鹽緩沖液（PBS0），組織勻漿器中進(jìn)行勻漿，勻漿液經(jīng)3 000 r/min離心15 min，上清液即為10%肝胰腺組織勻漿液，取勻漿液少許，按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書，測定勻漿液中可溶性蛋白質(zhì)濃度，其余的4℃保存，用于后續(xù)指標(biāo)測定。

1.2.4.3 超氧化物歧化酶活性

南京建成生物工程研究所試劑盒測定SOD的活性。血清中SOD活力單位定義：每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD酶活單位（U）；肝胰腺中SOD酶活力單位定義：每毫克蛋白質(zhì)中SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD酶活單位（U）。

1.2.4.4 一氧化氮合酶活性

南京建成生物工程研究所試劑盒測定NOS活性。血清中NOS酶活單位定義：每毫升血清每分鐘生成1 nmol一氧化氮為一個酶活力單位（U）；肝胰腺中NOS酶活單位定義：每毫克組織蛋白質(zhì)每分鐘生成1 nmol一氧化氮為一個酶活單位（U）。

1.2.4.5 酚氧化酶活性

參照南京建成生物工程研究所對蝦酚氧化酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用雙抗體夾心法測定樣品中對蝦酚氧化酶水平，標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中對蝦酚氧化酶的活性。

1.2.4.6 溶菌酶活性

南京建成生物工程研究所試劑盒測定LZM活性。測定原理：在一定濃度的混濁菌液中，由于LZM能水解細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖使細(xì)菌裂解，體系濃度降低，透光度增強(qiáng)，根據(jù)透光度變化推測LZM含量（1 μg=80 U）。

1.2.4.7 酸性磷酸酶活性

南京建成生物工程研究所試劑盒測定ACP活性。血清中ACP酶活單位定義：100 ml血清在37℃下，與基質(zhì)作用30 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位；肝胰腺中ACP酶活單位定義：每克組織蛋白質(zhì)，37℃下與基質(zhì)作用30 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.2.4.8 堿性磷酸酶活性

南京建成生物工程研究所試劑盒測定ALP活性。血清中ALP酶活單位定義：以100 ml血清在37℃與基質(zhì)作用15 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位；肝胰腺中ALP酶活單位定義：每克組織蛋白質(zhì)，37℃下與基質(zhì)作用15 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.2.4.9 總抗氧化能力

南京建成生物工程研究所試劑盒測定T-AOC。T-AOC用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示。血清T-AOC定義：與血清的測定OD值相同的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為mmol/l，肝胰腺T-AOC定義：與每克肝胰腺蛋白質(zhì)測定OD值相同的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為mmol/g prot.。

1.2.5 攻毒試驗

投喂28 d后，對4個處理組剩下的對蝦各取12只進(jìn)行攻毒，第3腹節(jié)肌肉注射副溶血弧菌菌株菌懸液（1.6×108cfu/ml)0.1 ml，對照組注射相同劑量的生理鹽水，記錄接種7 d后各組對蝦的累積死亡率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

各處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻對南美白對蝦生長及存活率的影響

試驗結(jié)束后，統(tǒng)計各處理組死亡只數(shù)，測定各存活對蝦體質(zhì)量，計算存活率和特定生長率，結(jié)果見圖1和圖2。添加小球藻的對蝦存活率明顯高于對照組，以1%添加組最高，為91.67%，2%添加組次之，為90.83%，對照組最低為83.33%，各飼喂組之間對蝦存活率沒有顯著性差異（P＞0.05）；飼喂2%小球藻的南美白對蝦的特定生長率最大，為4.84%，其次為1%添加組，為4.76%，對照組最低為3.38%，2%和1%小球藻添加組對蝦的特定生長率顯著高于對照組（P＜0.05）。由此可見，小球藻能夠提高南美白對蝦的存活率和特定生長率，綜合考慮，以1%的添加量最適宜。

2.2 小球藻對南美白對蝦血清非特異性免疫指標(biāo)的影響(見表2)

由表2可知，1%和2%小球藻添加組的南美白對蝦血清中SOD、NOS、PO、LZM、ACP和ALP活性及T-AOC含量均顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），0.5%添加組的南美白對蝦血清中的部分酶活（PO、LZM、ALP）顯著高于對照組（P＜0.05），其他酶活和總抗氧化能力高于對照組，但未達(dá)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 不同處理組凡納濱對蝦的存活率

圖2 不同處理組南美白對蝦的特定生長率

2.3 小球藻對南美白對蝦肝胰腺非特異性免疫指標(biāo)的影響(見表3)

表2 不同處理組對蝦血清中非特異免疫指標(biāo)的影響

表3 不同處理組對蝦肝胰腺中非特異免疫學(xué)指標(biāo)的影響

由表3可知，1%和2%小球藻添加組的南美白對蝦肝胰腺中SOD、NOS、PO、LZM、ACP和ALP活性及T-AOC含量均顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），0.5%添加組南美白對蝦肝胰腺中的酶活（SOD除外）和T-AOC含量均顯著高于對照組（P＜0.05），SOD的酶活高于對照組，但未達(dá)顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 小球藻對南美白對蝦攻毒死亡率的影響(見圖3)

從圖3看出，與對照組比較，飼喂小球藻飼料的對蝦死亡率明顯降低，0.5%添加組的死亡率為63.16%，1%添加組的死亡率為52.63%，2%添加組的死亡率為47.37%，而對照組的死亡率為73.68%，可見，小球藻可以提高南美白對蝦的機(jī)體免疫功能，從而降低攻毒死亡率。

3 討論

3.1 小球藻對南美白對蝦生長的影響

張玲等[13]經(jīng)過分析小球藻Chlorella sorokiniana C74的營養(yǎng)素，發(fā)現(xiàn)Chlorella sorokiniana C74含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，粗蛋白質(zhì)、多糖、油脂、灰分、粗纖維和色素分別占藻粉干重的20.4%、34.28%、22.16%、12.20%、20.22%和4.50%；含有多種不飽和脂肪酸，其中亞油酸和亞麻酸含量分別為22.73%和14.87%；氨基酸含量為17.50%，其中必需氨基酸為6.17%，通過必需氨基酸指數(shù)評價，指出該小球藻是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白來源。小球藻的保健功能自從被開發(fā)出來，已在許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。小球藻蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)成分齊全，在飼料中添加適量的小球藻能提高豬、肉雞和蛋雞的生產(chǎn)性能，改善雞蛋色澤，提高畜禽產(chǎn)品的品質(zhì)，明顯增加銀鯽的體重，降低飼料系數(shù)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，小球藻能夠顯著促進(jìn)南美白對蝦生長，為一種良好的對蝦飼料添加劑。

圖3 副溶血弧菌攻毒后不同處理組南美白對蝦的死亡率

3.2 小球藻對南美白對蝦免疫功能的影響

甲殼動物缺乏特異性免疫因子，主要以非特異性免疫抵御病原體的侵襲，包括血細(xì)胞的吞噬、包囊、凝集及血清和肝胰腺中酚氧化酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶等免疫因子的作用。有學(xué)者認(rèn)為，酚氧化酶以酶原形式存在于甲殼動物血細(xì)胞中，血細(xì)胞受刺激后將該酶原釋放到血淋巴中，并被激活表現(xiàn)出活性，它與血細(xì)胞的吞噬、包囊以及血淋巴的抗菌活性和外源物質(zhì)的識別有關(guān)[15]；超氧化物歧化酶在清除自由基、防止生物損傷方面起十分重要作用，可作為衡量甲殼動物免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一；溶菌酶是一種堿性蛋白，能水解革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的乙酰氨基多糖，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，從而擔(dān)負(fù)起機(jī)體防御的機(jī)能；堿性磷酸酶和酸性磷酸酶是動物溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，不僅能催化磷酸單酯水解，還直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移；總抗氧化能力是反映機(jī)體抗氧化作用的重要指標(biāo)之一。本研究通過在飼料中添加1%小球藻，發(fā)現(xiàn)小球藻能夠顯著或極顯著提高對蝦血淋巴和肝胰腺中的SOD、NOS、PO、LZM、ACP、ALP酶活和T-AOC含量，明顯降低對蝦的攻毒死亡率，從而明顯提高南美白對蝦的養(yǎng)殖存活率。