■ 呂宏偉 畢夢(mèng)凡 谷雪玲 肖克權(quán) 宋澤和 賀 喜 范志勇*

（1.湖南省畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

腸道微生態(tài)是腸道內(nèi)微生物與宿主形成的一個(gè)微生物系統(tǒng)，以乳酸桿菌為主的有益菌和以大腸桿菌、沙門(mén)氏菌為主的有害菌構(gòu)成的微生態(tài)平衡是維持動(dòng)物體健康的重要因素。為了提高畜禽的生產(chǎn)性能，改善腸道健康，提高腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量變得尤為重要。IMO和RFO作為益生元能夠明顯促進(jìn)乳酸桿菌等有益菌的增殖，且不被有害菌沙門(mén)氏菌或大腸桿菌所利用[1]，從而達(dá)到改善動(dòng)物腸道功能的作用。這在武書(shū)庚等[2]和劉佰陽(yáng)等[3]的研究中都被證實(shí)，而目前的研究中鮮有報(bào)道IMO與RFO之間的作用效果的比較，特別是對(duì)乳酸桿菌增殖和產(chǎn)酸效果的比較。因此，本試驗(yàn)通過(guò)比較IMO和RFO對(duì)于乳酸桿菌增殖和產(chǎn)酸效果的能力，闡明IMO與RFO之間的作用效果,為低聚糖在畜禽生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源

乳酸桿菌：德氏乳酸桿菌微膠囊粉制劑（活菌數(shù)≥1.01×109CFU/ml）由北京國(guó)家糧食局科學(xué)研究院生產(chǎn)包被，該菌種由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)功能微生物實(shí)驗(yàn)室篩選，武漢大學(xué)菌種保藏中心鑒定保藏（保藏號(hào)M207096）。

1.1.2 糖類

IMO和RFO由綠葉生物科技有限公司提供，500 g/瓶，純度98%。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯：用于乳酸桿菌的菌種活化，其配方（綠葉生物科技有限公司）如下：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀（無(wú)水）2.0 g，檸檬酸三銨（無(wú)水）2.0 g，硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳 0.05 g，乙酸鈉5.0 g，吐溫-80 1.0 ml，蒸餾水1 000 ml，pH值(5.7±0.2)。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

MRS液體培養(yǎng)基：用于IMO和RFO對(duì)乳酸桿菌的體外增殖試驗(yàn)。其配方（綠葉生物科技有限公司）如下：胰蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，酵母浸粉4.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，乙酸鈉5.0 g，吐溫-80 1.0 ml，蒸餾水1 000 ml，pH值(6.2±0.2)，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.4 儀器

超凈臺(tái)（蘇州江東精密儀器有限公司SW-CJ-2FD）、恒溫生化培養(yǎng)箱（ADX-SHP）、高壓蒸汽滅菌鍋（立式壓力蒸汽滅菌鍋 LDZX-50KBS）、烘箱（JINGHONG公司XMTD-8222）、移液槍（LICHENG公司W(wǎng)KYIII-200）、PH計(jì)（德國(guó)德圖 testo 205）、酶標(biāo)儀（Thermo公司 MULTISKAN GO）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分為對(duì)照（CON組，不含葡萄糖的MRS液體培養(yǎng)基）、IMO組（MRS中添加2.0%IMO）和RFO組（MRS中添加2.0%RFO），每組三個(gè)重復(fù)。分別于接種乳酸桿菌后0、8、16、24、32 h和40 h測(cè)定各處理培養(yǎng)基的OD值和pH值，并建立各組乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線圖和發(fā)酵液pH值曲線圖。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 菌種活化

將乳酸桿菌菌粉接種在MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)12～24 h，即為活化的乳酸桿菌菌液。

1.3.2 乳酸桿菌發(fā)酵液吸光度的測(cè)定

分別于接種后0、8、16、24、32 h和40 h用酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)酵液的OD420值。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，吸光度(OD值)可表示樣品菌液濃度[4]。

1.3.3 乳酸桿菌發(fā)酵液pH值的測(cè)定

于接種后0、8、16、24、32 h和 40 h用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel完成處理，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，若組間差異顯著，則采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖對(duì)乳酸桿菌增殖的影響（見(jiàn)圖1）

由圖1可知，與對(duì)照組相比，低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖均能顯著提高乳酸桿菌培養(yǎng)基OD值（P＜0.05）。發(fā)酵24 h之前，IMO組的乳酸桿菌數(shù)量顯著高于棉籽低聚糖組，但在24 h之后，RFO組中乳酸桿菌數(shù)顯著高于IMO組。

圖1 IMO和棉籽低聚糖對(duì)乳酸桿菌生長(zhǎng)作用曲線

2.2 低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖對(duì)乳酸桿菌發(fā)酵液pH值的影響(見(jiàn)圖2)

由圖2可知，與對(duì)照組相比，低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖均能明顯降低乳酸桿菌發(fā)酵液pH值（P＜0.05）。發(fā)酵24 h之前，IMO組的乳酸桿菌發(fā)酵液pH值明顯低于RFO組（P＜0.05）；在發(fā)酵24 h之后，RFO組的發(fā)酵液pH值明顯低于IMO組（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

乳酸桿菌作為益生菌在動(dòng)物腸道中發(fā)揮著重要的作用。乳酸桿菌可以產(chǎn)生乳酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)[5-6]，增強(qiáng)上皮細(xì)胞的屏障功能和免疫功能[7-9]。IMO作為一種益生元，能夠有效地促進(jìn)乳酸桿菌的增殖，具有調(diào)節(jié)消化道微生物區(qū)系的作用[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，離體培養(yǎng)條件下，IMO對(duì)乳酸桿菌呈現(xiàn)出明顯的增殖效果，其作用程度優(yōu)于葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，這與李曉卉[11]和房曉等[12]的研究相似。研究表明，益生菌對(duì)低聚糖的利用情況不僅與益生元種類有關(guān)，也存在時(shí)間差異。萬(wàn)榮峰等[13]在不含葡萄糖的肉湯培養(yǎng)基中添加低聚糖，乳酸桿菌在前24 h處于增值階段，而24～48 h乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在本試驗(yàn)中IMO和RFO對(duì)乳酸桿菌的增殖與時(shí)間密切相關(guān)，在16 h前IMO組乳酸桿菌增值效果顯著升高，而在16 h之后無(wú)顯著變化，RFO組在24 h前乳酸桿菌增殖效果顯著升高，而在24 h之后無(wú)顯著變化，說(shuō)明RFO的作用效果具有延后效應(yīng)。

圖2 低聚異麥芽糖和棉籽低聚糖對(duì)乳酸桿菌發(fā)酵液pH值的影響曲線

IMO和RFO均能顯著降低培養(yǎng)基的pH值，但其作用效果因低聚糖的種類而異。IMO組在0～24 h內(nèi)pH值顯著高于RFO組，而在24 h之后相反，說(shuō)明乳酸桿菌對(duì)低聚糖的利用具有選擇性，24 h可能是不同種類低聚糖對(duì)腸道菌群影響的分界點(diǎn)，這與劉露等[14]的研究相似。本試驗(yàn)表明，低聚糖對(duì)乳酸桿菌的pH值作用效果不僅與低聚糖種類有關(guān)，還存在時(shí)間差異。在16 h前IMO組pH值顯著降低，而在16 h后無(wú)顯著變化，RFO組在24 h前pH值顯著降低，而在24 h之后無(wú)顯著變化。產(chǎn)生這種作用效果的原因可能與糖分子的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，不同低聚糖分子內(nèi)的糖苷鍵對(duì)益生菌的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生不同的效果。本試驗(yàn)也證實(shí)了兩種低聚糖對(duì)乳酸桿菌生長(zhǎng)的影響也存在差異。

低聚糖在單胃動(dòng)物的胃內(nèi)不能被消化酶分解，在小腸中幾乎不能被利用，主要在后腸中被腸道菌群選擇性發(fā)酵，大多數(shù)有益菌能利用低聚糖，但是對(duì)低聚糖呈現(xiàn)出偏好性，所以乳酸菌對(duì)IMO和RFO的利用情況是不同的，這呈現(xiàn)出了菌株的特異性?？傮w來(lái)說(shuō)，乳酸菌的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酸速率呈正相關(guān)，但這一現(xiàn)象并不絕對(duì)，例如生長(zhǎng)速率接近的兩株干酪乳酸菌，產(chǎn)酸速率相差較大，說(shuō)明即使是同一種菌，對(duì)同種低聚糖的利用特性也可能不同。劉思思[15]研究表明，菌株的定殖性能與菌株利用低聚糖的能力可能有關(guān)，但并不與低聚糖利用能力呈正相關(guān)，只有長(zhǎng)期使用低聚糖，菌株的定殖性能才會(huì)延長(zhǎng)。低聚糖對(duì)乳酸菌增殖的作用機(jī)理在于低聚糖不只充當(dāng)一種碳源或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可能參與了乳酸菌的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。細(xì)菌利用低聚糖通常需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖苷酶的參與[16],目前已在乳酸菌中分離出純化的β-葡萄糖苷酶、谷氨酸脫羧酶、脫氧胞苷激酶等，不同的酶活性不同，乳酸桿菌對(duì)IMO和RFO的利用率可能和這些酶與IMO和RFO的反應(yīng)速率有關(guān)，后續(xù)可以從乳酸菌的代謝途徑或降解低聚糖的酶系統(tǒng)甚至是基因?qū)用孢M(jìn)行差異探究。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，IMO和RFO均能顯著促進(jìn)乳酸桿菌的增殖，其作用效果與低聚糖的種類和時(shí)間有關(guān)。因此，生產(chǎn)中可根據(jù)目的合理的選擇低聚糖，也可根據(jù)不同低聚糖的作用進(jìn)行組合使用。