■吳坤坦 齊德生

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)系，湖北武漢430070）

黃曲霉毒素主要是黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一類高致癌致畸性的次級代謝產(chǎn)物，包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。其中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性和致癌性極強(qiáng)，其次是黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）。哺乳動(dòng)物攝入的AFB1主要在肝臟由多種細(xì)胞色素氧化酶如CYP1A2作用形AFBO后發(fā)生進(jìn)一步代謝，或者羥化其末端呋喃上C-10生成AFM1并進(jìn)入乳汁中。AFB1在乳腺組織和瘤胃中也可代謝產(chǎn)生AFM1，因此減少AFM1向乳汁的轉(zhuǎn)移，保障奶產(chǎn)品的食品安全越來越受到人們的關(guān)注。

1 AFB1在肝臟的代謝

1.1 AFB1在肝臟中的代謝過程

AFB1因其在未被代謝活化之前不具有致癌性而被稱為前致癌物，經(jīng)過代謝激活后形成環(huán)氧化物才具有致癌性(蒿艷蓉等，2009)。

動(dòng)物主要是在腸道吸收AFB1，而肝臟對AFB1進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，攝入后約有50%～60%的AFB1在十二指腸被吸收，未被吸收的AFB1通過糞便排出體外。AFB1進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)體內(nèi)多種P450家族(如CYP1A2、CYP3A4、CYP2A6等)代謝轉(zhuǎn)化為多種代謝產(chǎn)物(齊琪，2012)。CYP1A2作為肝臟中公認(rèn)代謝AFB1的優(yōu)勢酶，可將AFB1氧化為AFM1、AFQ1和AFB1-endo-8，9-環(huán)氧化物，而CYP3A4氧化AFB1為AFQ1和AFBO，其中AFM1、AFP1、AFB1-endo-8，9-環(huán)氧化物可直接經(jīng)尿液排出體外(蒿艷蓉等，2009)。但近年來有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，CYP2A13也可以高效代謝活化AFB1，但CYP2A13在人呼吸道器官中特異性高表達(dá)，而CYP1A2幾乎不在該組織中發(fā)揮作用，因此CYP2A13可能與呼吸組織代謝AFB1有關(guān)(陸慧媛，2012)。AFM1在動(dòng)物體內(nèi)生成后，部分可與葡萄糖醛酸結(jié)合經(jīng)膽汁進(jìn)入小腸并經(jīng)糞便排出體外(Stubblefield等，1983)，由于羥基可使其水溶性提高，因此AFM1可通過尿液、膽汁和乳汁迅速排泄(Egmond，1983)。一部分AFBO可與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）在機(jī)體Ⅱ相轉(zhuǎn)移酶如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs）作用下結(jié)合，形成AFB1-硫醇尿酸（AFB1-mercaptutic acid，AFB1-NAC）并經(jīng)尿排出體外(Swenson等，1977)；另一部分AFBO與DNA結(jié)合形成AFB1-N7-鳥嘌呤加合物(aflatoxin-N7-guanine，AFB1-N7-GUA)。通過DNA修復(fù)過程可快速將大部分AFB1-N7-GUA加合物清除后通過尿液排出體外(蒿艷蓉等，2009)；還有一部分與血清白蛋白結(jié)合后主要以AFB1-賴氨酸復(fù)合物的形式殘留于血液中；此外，還有約五分之一的AFBO開環(huán)后毒性降低，以AFB1-甲酰氨基嘧啶復(fù)合物經(jīng)尿液排出體外。其轉(zhuǎn)化過程可歸納如圖1所示。

圖1 AFB1在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的過程

1.2 AFB1在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)

AFB1攝入后主要在肝腎處積累且肝臟中的毒素濃度低于腎臟。Shreeve等(1979)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AFM1都出現(xiàn)在牛的腎臟，且腎臟中AFM1的濃度顯著高于肝臟，說明AFM1主要?dú)埩粲谀I臟中。Stubblefield等給奶?？诜S曲霉毒素后，幾乎在牛的所有組織樣本中都發(fā)現(xiàn)了兩種黃曲霉毒素；肝臟中AFB1濃度比AFM1高，而腎臟AFB1水平比AFM1低，說明不同組織內(nèi)主要?dú)埩舻亩舅夭幌嗤?/p>

AFB1的主要排泄途徑是糞便。有報(bào)道指出糞便排泄出含量最高的黃曲霉毒素是AFB1，同時(shí)也檢出了AFM1(Allcroft等，1968)。有學(xué)者給泌乳山羊口服放射元素標(biāo)記的AFB1后檢出約為攝入量50%的AFB1(黃帥等，2015)。純品AFB1向乳中轉(zhuǎn)化效率高于飼料AFB1，且添加高劑量AFB1組轉(zhuǎn)化效率低于低劑量組，這可能是高濃度毒素還未完全吸收便排出體外的緣由(姜雅慧等，2010)。

2 飼料中的AFB1轉(zhuǎn)化為乳中AFM1的過程

在肝臟中AFB1末端呋喃上C-10被羥化生成AFM1后約數(shù)小時(shí)便可排泄到乳中，而經(jīng)過幾天便可完全清除。AFM1也可由曲霉菌直接產(chǎn)生，但比例較低(王蕾，2008)。研究表明AFM1轉(zhuǎn)移至乳中的比例約為攝入AFB1為0.1%～6%，高產(chǎn)奶?？筛哌_(dá)6.2%(Coffey等，2009)。Britzi等(2013)建立了AFM1轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)奶量之間的回歸方程：轉(zhuǎn)化率=0.515 4e0.0521×產(chǎn)奶量(R2=0.622 4)，不同泌乳階段之間AFM1的轉(zhuǎn)化率也存在著巨大差異，結(jié)果反映AFM1的轉(zhuǎn)化率隨著產(chǎn)奶量的增加而提高。相關(guān)性統(tǒng)計(jì)說明原奶中AFM1與飼料中AFG1和AFG2之間無明顯相關(guān)性而與飼料中AFB1之間存在正相關(guān)關(guān)系(徐華坤，2013)。

有許多外界和動(dòng)物的因素變化會影響到AFM1進(jìn)入乳中的含量，如AFB1攝入量、物種差異、乳腺細(xì)胞健康情況、飼料中青貯料的比例等(黃帥等，2015)，泌乳階段的不同也能導(dǎo)致AFM1的轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)較大差異，兩者呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。產(chǎn)奶量是影響AFM1轉(zhuǎn)化效率的主要因素而體細(xì)胞數(shù)與AFM1的轉(zhuǎn)化率并不相關(guān)(Masoero等，2007)。實(shí)際生產(chǎn)情況可能更為復(fù)雜，因?yàn)殡S著奶牛個(gè)體和健康的差異和生產(chǎn)水平的不同，奶牛和AFB1接觸時(shí)間的不同，轉(zhuǎn)化率可能會差異很大，大多數(shù)試驗(yàn)表明AFM1在乳汁中的轉(zhuǎn)移率平均值為1.7%(Coffey等，2009)。由此看來，奶牛日糧中AFB1濃度即使低于20 μg/kg，也有可能導(dǎo)致牛奶中AFM1殘留超過0.4 μg/kg，因此可以推測，假設(shè)日糧中攝入AFB1水平基本不變，牛奶中AFM1殘留卻有可能在某一時(shí)期超標(biāo)。如果按照1.7%的轉(zhuǎn)化率計(jì)算，那么當(dāng)日糧AFB1含量大于30 μg/kg時(shí)，牛奶中AFM1的含量就會超過0.5 μg/kg；當(dāng)日糧中AFB1含量大于3 μg/kg時(shí)，牛奶中AFM1的含量就會超過0.05 μg/kg(紀(jì)少麗等，2012)，并且當(dāng)牛奶濃縮加工后情況變得更為嚴(yán)重。

AFM1主要是通過尿液排泄的，AFB1也可經(jīng)此途徑排出體外。Galtier（2010）研究AFB1經(jīng)消化吸收和肝膽循環(huán)后平均約2%出現(xiàn)在尿液中，而Helferich等（1986）研究發(fā)現(xiàn)口服放射元素標(biāo)記的AFB1后，尿液檢測到放射性物質(zhì)總量占攝入量不足三分之一，這說明AFB1不是通過尿液排出體外。Fernandez等（2015）讓24頭在泌乳期的山羊每日采食含2.5 mg/(kg·d)黃曲霉毒素的日糧三周后檢測尿液，發(fā)現(xiàn)尿液中含量最高的黃曲霉毒素是AFM1。

3 AFB1對乳腺上皮細(xì)胞的影響

乳畜攝入的AFB1在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為AFM1并隨著乳汁排出，這一過程通常被認(rèn)為是排毒過程，因?yàn)锳FM1的毒性大約只是AFB1的10%，但AFM1進(jìn)入乳制品后持續(xù)危害著人類的健康(陳丹，2016)。乳腺上皮細(xì)胞間形成的緊密連接（又稱為血乳屏障）是阻止某些物質(zhì)由血液進(jìn)入乳腺組織的天然屏障，具有不可滲透的特性。同某些治療藥物一樣，霉菌毒素需要特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，并且轉(zhuǎn)運(yùn)效率受到血液pH值變化影響很大。正常機(jī)體內(nèi)血液pH值高于牛奶pH值，但有些疾?。ㄖ饕侨榉垦祝┗蛘咚幬飼?dǎo)致兩者pH值接近甚至顛倒，造成轉(zhuǎn)運(yùn)效率提高，AFB1轉(zhuǎn)化率高于平常(施瓊等，2012)。BME-UV1具有乳腺上皮細(xì)胞的功能和生化標(biāo)志物，并能夠合成α-乳清蛋白和α-酪蛋白，因此常作為牛乳腺上皮代謝模型來研究AFB1的代謝和細(xì)胞毒性，在BME-UV1細(xì)胞中添加2～16 μmol/l AFB1培養(yǎng)24 h后細(xì)胞活力便出現(xiàn)差異性(Caruso等，2009)；而Caruso等(2008)用2～8 μmol/l處理后，檢測出AFM1的轉(zhuǎn)化率約為0.01%～0.1%；Kamataki等(1992)與Kitamura等(1992)也用MCF-7細(xì)胞檢測AFB1的細(xì)胞毒性。

環(huán)境中的有毒物質(zhì)可能也是某種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的配體。有的物質(zhì)自身便可以增加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，有的則是在其它物質(zhì)的干預(yù)下提高轉(zhuǎn)運(yùn)效率。ABCG2基因在奶牛、小鼠和人的乳腺組織中均有表達(dá)(Jonker等，2005)，其蛋白在藥物與毒素轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用。在乳腺組織中，AFB1是在ABCG2蛋白協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)到乳汁中(Van Hawarden等，2006)，使其在乳汁中的濃度被大大提高，AFM1作為AFB1的代謝產(chǎn)物也有可能是由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的(Sarkadi等，2004)。陳丹(2016)對ABCG2基因進(jìn)行過表達(dá)后，乳腺細(xì)胞中AFM1的含量顯著升高；而基因抑制后毒素含量下降，說明AFM1在乳腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)中ABCG2基因發(fā)揮了重要作用。二噁英類物質(zhì)（如PCB-126）污染牧草并被乳畜長期攝入可增強(qiáng)ABCG2蛋白向牛奶中的轉(zhuǎn)運(yùn)外源性物質(zhì)的潛力，導(dǎo)致AFM1在乳制品中含量大幅增加(Manzini等，2017)。STAT5A基因在乳腺上皮細(xì)胞的生長和增殖中起著非常重要的作用，并影響上皮細(xì)胞的間隙連接，AFB1處理細(xì)胞可能誘導(dǎo)了DNA損傷，引起STAT5A基因表達(dá)下調(diào)了約80%(Forouharmehr等，2013)。因此，通過研究AFB1對乳腺細(xì)胞的影響和機(jī)理，進(jìn)而探索降低AFM1進(jìn)入乳汁的措施和影響轉(zhuǎn)化的因素，為降低有害物質(zhì)污染奶及奶制品的水平，保障乳制品安全提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。未來可應(yīng)用在研究其它毒物與藥物穿越血乳屏障的機(jī)制機(jī)理。

4 AFB1在瘤胃中的代謝

4.1 AFB1在瘤胃中的代謝研究

有許多學(xué)者研究了AFB1在瘤胃中的代謝。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素在山羊中的代謝率比閹牛高兩倍以上(Upadhaya等，2009)，瘤胃壁可以快速吸收AFB1在肝臟代謝，直到120 min后AFB1才主要由腸道吸收(Moschini等，2010)。還有學(xué)者注意到瘤胃微生物與黃曲霉毒素之間的相互作用。Fedele等（2010）報(bào)道了在體外發(fā)酵瘤胃液中添加1 mg/kg的AFB1僅1 h后代謝率達(dá)到90%并檢測到AFM1；Auerbach等（1998）用14C標(biāo)記AFB1后在瘤胃內(nèi)容物中只發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素醇的產(chǎn)生，認(rèn)為檢測到的AFM1是肝臟產(chǎn)生后通過瘤胃-肝臟通路循環(huán)返回至瘤胃中的。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)AFB1在瘤胃中沒有發(fā)生明顯降解(Westlake等，1989)。有學(xué)者研究體外靜態(tài)培養(yǎng)的瘤胃微生物對毒素的代謝，在培養(yǎng)物中添加不同濃度的AFB1后降低了氨態(tài)氮濃度和甲烷產(chǎn)量，同時(shí)總揮發(fā)性脂肪酸和乙酸、丙酸等產(chǎn)量也逐漸下降（P＜0.05），并抑制了纖維素酶活(姜雅慧等，2010)，這可能是AFB1擾亂了瘤胃微生物的繁殖和功能的緣故。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性脂肪酸在10 μg/ml毒素時(shí)濃度較低，推測在該水平下與纖維分解相關(guān)的微生物的活性受到抑制(齊琪，2012)。

4.2 降解AFB1的微生物

目前已報(bào)道的去除黃曲霉毒素的菌株基本上是通過菌體細(xì)胞壁的吸附作用來發(fā)揮作用，而目前得到的、降解AFB1的微生物在體外的最佳條件下降解效果較好，但缺乏進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證。雷元培等（2011）分離出的枯草芽孢桿菌，能夠產(chǎn)生降解AFB1和AFM1胞外酶，其菌體培養(yǎng)物對AFB1和AFM1的分解率可達(dá)到81%和63%，且此細(xì)菌抗逆性及抗菌性均較好。李超波等（2012）報(bào)道了一株施氏假單胞菌能夠降解黃曲霉毒素B1，但降解效率較低，72 h后分解率才能達(dá)到82.91%。Farzaneh等（2012）報(bào)道的菌株UTBSP1能在24 h內(nèi)降解85.66%的AFB1。張志敏等（2014）從秦川牛瘤胃中分離到芽孢桿菌WZ-2，在體外發(fā)酵培養(yǎng)72 h可使AFB1分解率達(dá)到79%，他同時(shí)還指出長期接觸霉菌毒素的反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物中可能存在能降解霉菌毒素的細(xì)菌。崔玉琦（2014）從非洲象糞便中分離的芽孢桿菌E-1-1-1產(chǎn)生的胞外酶的五個(gè)組分蛋白對AFM1有不同程度的降解，而組合后最優(yōu)條件下分解率達(dá)到了94.3%，可能降解黃曲霉毒素的活性蛋白是一種復(fù)合蛋白的緣故。

4.3 微生物降解AFB1研究現(xiàn)狀

黃曲霉毒素的脫毒按類型可分為物理脫毒法、化學(xué)脫毒法和生物脫毒法，生物脫毒法又分為吸附脫毒和降解脫毒兩方面。吸附脫毒由于吸附過程是可逆的，外界變化后可能將吸附的毒素重新釋放出來，造成使用時(shí)效果不穩(wěn)定；而降解脫毒直接將毒素降解為低毒或無毒物質(zhì)更加安全徹底。直接將微生物用于降解黃曲霉毒素的報(bào)道不多，目前較為有效的辦法是利用微生物的胞外代謝產(chǎn)物來分解黃曲霉毒素(崔玉琦，2014)，李超波等（2012）指出，雖然真菌能夠降解黃曲霉毒素，但消耗時(shí)間長且不完全，因而影響實(shí)際應(yīng)用。國內(nèi)報(bào)道關(guān)于AFB1降解菌主要有嗜麥芽窄食單胞菌、施假單胞菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌和醋酸菌等，其中酵母和乳酸菌這些微生物主要是通過細(xì)胞壁吸附毒素(朱新貴等，2001)。有許多研究發(fā)現(xiàn)能降解黃曲霉毒素的微生物有細(xì)菌，霉菌，酵母菌等，但考慮到代謝副產(chǎn)物如色素以及菌株生長條件差異大，其實(shí)際使用效果有待提高。例如有學(xué)者在40頭生長育肥牛日糧中添加AFB1分解酶，僅有平均日增重提高11%(崔捷，2013)，并且缺乏相關(guān)代謝酶添加劑應(yīng)用飼料中降解黃曲霉毒素的報(bào)道。因此今后利用分子生物學(xué)、基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)等手段，對解毒酶提取液進(jìn)行分離純化獲得單一活性蛋白，同時(shí)克隆有效成分蛋白基因并在載體中進(jìn)行高效表達(dá)，這是飼料安全新的研究趨勢(計(jì)成等，2010)。

5 牛奶中AFM1的控制措施

奶牛攝入AFB1及其代謝產(chǎn)物后不僅危害健康進(jìn)而引起代謝疾病，還會降低生產(chǎn)性能和免疫力，最后進(jìn)入牛奶中威脅乳制品的食品安全。我國《GB 13078—2017》中對飼料中AFB1的標(biāo)準(zhǔn)是不高于20 μg/kg，而《GB 2761—2017》規(guī)定乳和乳制品中AFM1的不高于0.5 μg/kg；FDA和歐盟《EU NO.165/2010》中要求中AFM1的含量不高于0.05 μg/kg，而對嬰幼兒的奶粉不高于0.025 μg/kg。因此采取有效措施控制牛奶中AFM1十分重要。根據(jù)控制階段的不同可劃分為預(yù)防黃曲霉毒素的產(chǎn)生、脫去飼料中的毒素或者去除毒素的毒性和消除牛奶中的AFM1等幾個(gè)環(huán)節(jié)。

5.1 預(yù)防黃曲霉毒素的產(chǎn)生

重視飼料原料質(zhì)量和安全，減少日糧中攝入黃曲霉毒素水平是控制牛奶中AFM1最為經(jīng)濟(jì)有效的措施?？赏ㄟ^培育抗曲霉菌的作物、科學(xué)計(jì)劃安排種植與收獲和適當(dāng)運(yùn)輸與倉儲措施來降低飼料中霉菌毒素的水平，從源頭控制牛奶中的毒素水平(Bryden,2001)。通過對原料控制可以有效減少奶牛對黃曲霉毒素的攝入，但這些還不足以保障乳制品的食品安全，因此需要采取其他措施來進(jìn)一步減少AFM1的殘留風(fēng)險(xiǎn)。

5.2 物理、化學(xué)與生物解毒法

對于已經(jīng)存在于飼料中黃曲霉毒素可采用多種方法脫去或者降低毒性，有物理解毒法、化學(xué)解毒法和生物解毒法。物理解毒法包括高溫失活、射線處理以及微生物細(xì)胞壁脫毒法等；化學(xué)解毒法是通過酸堿溶液等化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行處理，但是存在飼料營養(yǎng)物質(zhì)損失較大、污染環(huán)境和成本高等問題。生物脫毒法是通過添加微生物或者相關(guān)酶對毒素進(jìn)行降解，有許多學(xué)者在體外分離到降解效果較好的枯草芽孢桿菌等，但缺乏進(jìn)一步體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證，并且存在成本和使用效果不佳等問題。目前使用較廣的解毒方法是礦物質(zhì)吸附法，它的原理是利用膨潤土、硅鋁酸鹽及活性炭等吸附性強(qiáng)的物質(zhì)吸附霉菌毒素，從而顯著降低霉菌毒素被機(jī)體吸收代謝的濃度(施瓊等，2012)。

5.3 消除牛奶中的AFM1

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周的存儲，pH值為4.6的酸奶中AFM1并沒有顯著減少;然而pH值為4.0的酸奶經(jīng)過4周存儲后，2種污染濃度酸奶中的AFM1均發(fā)生了明顯減少。因此，低pH值可能會降低AFM1的含量(Govaris等，2002)。有研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理能夠清除32%以上的AFM1(Purchase，1967)，使用酸奶中不同菌株的乳酸菌可以降低AFM1水平(Elsanhoty等，2014)。

6 小結(jié)

目前我國對于奶制品的安全采取了一些措施，但嬰幼兒奶粉食品安全事件仍然時(shí)有發(fā)生，這反映了目前針對乳制品的安全控制措施仍不完善，因此牛奶中的安全問題持續(xù)受到人們的廣泛關(guān)注。AFM1殘留超標(biāo)作為目前危害乳制品安全的主要問題，控制其污染水平，確保國民健康安全已經(jīng)迫在眉睫。解決這些問題首先應(yīng)以預(yù)防為主，給乳畜飼喂優(yōu)質(zhì)的日糧，從源頭上減少黃曲霉毒素的攝入；其次輔以一些解毒劑和脫毒劑，減少黃曲霉毒素的吸收和代謝；還可以在瘤胃和消化道定植有益的微生物降解毒素，并且研究黃曲霉毒素對乳腺上皮細(xì)胞的影響和機(jī)理，對減少毒素穿越血乳屏障以及增加動(dòng)物對毒素的代謝率，維持乳畜健康都有著重要意義。