李衛(wèi)，孟慶剛，楊琪，曲志偉，畢佳琦，成勇，林琛，李寶林，劉銳

（哈爾濱市第一醫(yī)院 手外科，黑龍江 哈爾濱 150001）

手部外傷后瘢痕組織嚴重影響患肢的功能，治療效果往往不佳，而聲動力療法一直是近年來研究熱點[1]。我們前期研究結(jié)果已表明，DVDMS-SDT效應(yīng)對增生性瘢痕成纖維細胞有毒殺作用。本實驗通過各種實驗方法為DVDMS-SDT效應(yīng)抗人瘢痕研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實驗細胞復(fù)蘇培養(yǎng)與生長

取人增生性瘢痕組織(離體后4 h內(nèi))，將所得標本用生理鹽水漂洗數(shù)次，去除上皮部分，切成2 mm×2 mm大小的組織塊，送入無菌培養(yǎng)瓶中，按一定間距平鋪，向瓶中加入少量培養(yǎng)液。將組織塊鋪于瓶底培養(yǎng)，細胞經(jīng)3～4次傳代培養(yǎng)后處于對數(shù)生長期(取第5代之內(nèi)的細胞用于本實驗研究)，待細胞70%～80%融合時用于實驗。取對數(shù)生長期細胞，以每孔5×105個細胞、200μL培養(yǎng)液分別均勻接種于96孔培養(yǎng)板中[2]。每種實驗條件均設(shè)3復(fù)孔。所有人員簽署知情同意書并經(jīng)哈爾濱市第一醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 實驗分組及DVDMS-SDT作用

分為對照組（C組）、單純超聲組（U組）、單純?nèi)A卟啉鈉藥物組（DVDMS組）、華卟啉鈉聲動力組（DVDMS-SDT）。超聲輻照儀：天使牌，美國斯坦福大學(xué)超聲波實驗室聯(lián)合北京（中美）天使科技有限公司產(chǎn)品。治療參數(shù)：超聲頻率1.0 MHz(兆赫)，超聲聲強0.8 W/cm2，超聲輻照時間120 s，每日1次。向培養(yǎng)皿中注射DVDMS（2μg/mL），華卟啉鈉由青龍高科技股份有限公司研制，規(guī)格10 mg/瓶，l，3 h后進行超聲輻照，超聲探頭在水中與瘢痕相距1.0 cm[2]。

1.3 MTT法檢測細胞增殖能力

實驗分組如下（每組3 mL細胞懸液）：C組、U組、DVDMS組、DVDMS-SDT組。超聲輻射條件同上，超聲輻射后，用臺酚藍立刻進行細胞計數(shù)，調(diào)整幸存的人增生性瘢痕成纖維細胞密度至1×105個細胞/mL，分別接種于96孔板，200μL/孔，每組種5復(fù)孔，置于37℃，5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。分別于12，24，36，48h各取一塊96孔板加MTT20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸掉上清液，加入DMSO每孔200μL振蕩10 min，用自動酶標儀檢測在490 nm波長下各孔OD值。本實驗重復(fù)3次。將預(yù)處理的細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，根據(jù)試劑盒依次加入MTT20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入溶解液，振蕩搖勻，酶聯(lián)免疫檢測儀測定，計算，本實驗重復(fù)3次。

1.4 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)線粒體跨膜電位

實驗分為四組（每組3 mL細胞懸液），DVDMS濃度：2μg/mL（于超聲輻照前4 h加入），超聲輻照前3.5 h加入羅丹明123（10μg/mL）0.5 mL。超聲輻照條件：0.80 W/cm2×120 s。超聲輻照后，將四組細胞分別轉(zhuǎn)入50 mL培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3 h后收集細胞，參照文獻方法，PBS洗2次去血清，37℃避光孵育30 min，PBS漂洗2次，加入0.5 mL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm。

1.5 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平

取對數(shù)生長期的人增生性瘢痕成纖維細胞，常規(guī)處理后，DVDMS濃度：2μg/mL（于超聲輻照前4 h加入），超聲輻照前3.5 h，加入DCFH-DA 10μmoL/L的，加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，方法同上檢測。

1.6 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子水平

取對數(shù)生長期的人增生性瘢痕成纖維細胞，常規(guī)處理后，超聲輻照前3.5 h加 Fluo-3-Am 5μL（10μmol/L），置二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，其間輕微振蕩3次，方法同上，檢測超聲輻照條件同上。超聲輻照后，輻照3 h后收集細胞，離心去掉多余染料，再用無鈣緩沖液反復(fù)洗滌3次，最后用無鈣緩沖液稀釋至1 mL，于流式細胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm。

1.7 螢光顯微鏡觀察（Hoechst33258染色法）

取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)處理后，以每孔1 mL接種在24孔板內(nèi)。24 h后取有細胞生長良好且均勻的血蓋片，超聲輻照條件同上。超聲輻照后，將細胞爬片置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后取出細胞爬片，用PBS洗2次去血清，加入1 mL的4%甲醛溶液，4℃固定細胞10 min，用PBS洗2次，滴加 Hoechst 33258染液100μL，室溫染色10 min，蒸餾水沖凈晾干，以紫外光波長激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DVDMS-SDT作用對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響

DVDMS-SDT作用對人增生性瘢痕成纖維細胞生長的影響結(jié)果見表1，從表1可見，DVDMS-SDT組光密度值明顯較同一時間點C組、DVDMS組、U組低（P＜0.01）。而DVDMS對人增生性瘢痕成纖維細胞的生長無明顯抑制作用。

2.2 DVDMS-SDT作用對人增生性瘢痕成纖維細胞線粒體跨膜電位的影響

本實驗用羅丹明123作為熒光探針測定人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)的線粒體跨膜電位。從流式細胞儀分析結(jié)果圖中可清楚地看到兩個峰值，表明人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)線粒體跨膜電位的減少只發(fā)生在部分細胞中，因而該結(jié)果以百分比表示較為科學(xué)。三組細胞線粒體跨膜電位降低的百分比分別為：C 組(7.76±1.63)%，DVDMS 組（10.74±0.72）%，U組(20.45±4.76)%，DVDMS-SDT 組(54.36±9.13)%，可見DVDMS-SDT組線粒體跨膜電位均明顯下降，與C組、DVDMS組、U組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 DVDMS-SDT作用對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響

2.3 DVDMS-SDT作用對人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)活性氧水平的影響

本實驗用DCFH-DA染料孵育后流式細胞儀檢測，DCF的熒光強度增高的細胞百分比分別為：C組(1.87±0.67)%、DVDMS 組 （7.01±1.73%），U 組(28.73±2.87)%、DVDMS-SDT 組(70.93±2.76%)，可見后兩組活性氧水平明顯高于對照組（P＜0.01），尤其以DVDMS-SDT最為顯著，與C組、DVDMS組、U組比較，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 DVDMS-SDT作用對人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)鈣離子水平的影響

本實驗用 Fluo-3-Am染料孵育后流式細胞儀檢測，F(xiàn)luo-3與鈣離子集合后熒光強度增高的細胞百分比分別為：C組(1.32±0.35)%、DVDMS組（2.76±1.39%）、U 組 (32.67 ±1.09%)、DVDMS-SDT 組(60.67±4.32%)，可見后兩組鈣離子水平明顯高于對照組（P＜0.01），尤其以DVDMS-SDT組最為顯著，與C組、DVDMS組、U組比較，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖 1-4）。

2.5 螢光顯微鏡觀察人增生性瘢痕成纖維細胞核的變化

細胞核的變化是細胞壞死和凋亡的主要標志，C組：人增生性瘢痕成纖維細胞核清晰可見，染色均勻，邊界清楚，大小不一，形狀不一。DVDMS組：人增生性瘢痕成纖維細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與對照組比較無明顯改變，細胞核染色均勻，輪廓清楚，偶見細胞輕微腫脹。SDT組和U組都有細胞損傷，SDT組細胞的損傷程度明顯大于單純超聲作用，部分細胞核染色質(zhì)濃縮，染色加深,核體積縮小，即核濃縮。U組：其細胞損傷的數(shù)量和程度明顯低于DVDMS組，部分人增生性瘢痕成纖維細胞出現(xiàn)核濃縮。

圖1 -4 DVDMS-SDT效應(yīng)對人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)鈣離子的影響

3 討論

增生性瘢痕是皮膚損傷后組織異常修復(fù)的一種病理現(xiàn)象，其高發(fā)生率嚴重影響患者的生活質(zhì)量，目前尚缺乏有效的治療方法。我們前期研究發(fā)現(xiàn)DVDMS-SDT療法用于治療兔增生性瘢痕具有顯著的療效，能夠顯著引起增生性瘢痕中成纖維細胞的凋亡。人增生性瘢痕目前現(xiàn)有的手段治療效果均不理想，因而一直是臨床研究的熱點[4]，因此我應(yīng)用DVDMS作為聲敏劑，探討從細胞增殖狀況觀察DVDMS-SDT效應(yīng)對人增生性瘢痕成纖維細胞的遲發(fā)抑制作用，并初步探討其作用機制，為增生性瘢痕治療提供新的手段。

本實驗MTT檢測結(jié)果證實單純超聲作用后人增生性瘢痕成纖維細胞增殖代謝活性下降，而在DVDMS存在時，人增生性瘢痕成纖維細胞增殖代謝活性下降更明顯，但DVDMS對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖活性無明顯影響。提示本實驗條件下SDT作用降低了人增生性瘢痕成纖維細胞的增殖代謝活性。由于 MTT法檢測反映的是活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶的活性，故本實驗結(jié)果亦表明SDT作用后人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的代謝活性降低。在DVDMS-SDT治療過程中，聲敏劑經(jīng)超聲輻照后產(chǎn)生的 ROS是誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的一大原因，眾多研究表明細胞內(nèi) ROS所致的氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)細胞凋亡[5]?；钚匝酰≧eactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生是聲動力治療（SDT）殺傷細胞的主要機制。超聲通過作用于細胞內(nèi)的水相環(huán)境引起聲空化效應(yīng)，通過激活增敏劑產(chǎn)生大量的ROS，從而直接介導(dǎo)細胞毒性作用。在細胞中產(chǎn)生活性氧分子ROS，如超氧陰離子等自由基。當細胞在內(nèi)外環(huán)境的刺激后，ROS產(chǎn)生增多，從而破壞了機體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激。本實驗應(yīng)用DCFH-DA染料檢測了SDT作用后人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)ROS水平的變化。本實驗流式細胞儀分析結(jié)果表明，在單純超聲輻照后人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)ROS水平有所增加，而在DVDMS-SDT作用后 ROS增加更明顯，提示在該過程中有 ROS的參與。細胞內(nèi)的ROS成分是誘導(dǎo)人增生性瘢痕成纖維細胞壞死與凋亡的主要因素[6]。在SDT作用過程中，DVDMS受超聲輻照后可能首先產(chǎn)生氧自由基，而后這些基團與細胞的某些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生新的ROS繼續(xù)損傷細胞。在體內(nèi)、外實驗證明，阻止線粒體通透性的改變可以防止細胞凋亡。本實驗采用羅丹明123來檢測細胞內(nèi)線粒體跨膜電位的變化，提示SDT作用對人增生性瘢痕成纖維細胞的線粒體損傷較重，說明在SDT誘導(dǎo)后人增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的過程中，線粒體發(fā)揮了重要作用。因此，可以認為在本實驗條件下，SDT作用后線粒體內(nèi)ROS的蓄積所造成的線粒體氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，線粒體膜通透性增加及跨膜電位下降可能是SDT作用誘導(dǎo)人增生性瘢痕成纖維細胞凋亡和死亡的重要機制。鈣穩(wěn)態(tài)失衡也是細胞凋亡的重要機制之一[6]，本實驗顯示DVDMS-SDT同樣增高了人增生性瘢痕成纖維細胞內(nèi)鈣離子，與C組、DVDMS組、U組相比，統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

綜上所述，SDT對人增生性瘢痕成纖維細胞有遲發(fā)抑制作用，我們認為，超聲一方面通過超聲的機械作用可能直接破壞細胞，特別是膜結(jié)構(gòu)，另一方面通過空化效應(yīng)激活 DVDMS后產(chǎn)生一系列的自由基，鈣離子濃度增高，線粒體膜電位的改變而且相互作用，從而抑制人增生性瘢痕成纖維細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡。