金淑秀，王鈺慧，霍乃蕊*，鄭明學(xué)，韓克光，古少鵬，田文霞，張 鼎

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是由于成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)介導(dǎo)的骨吸收失衡，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成而引起的以骨小梁稀疏、斷裂、骨量減少、骨密度下降為特征的骨代謝疾病[1-2]。受集約化養(yǎng)殖、環(huán)境污染、動(dòng)物生產(chǎn)、其他疾病發(fā)生等因素的影響，畜禽OP越來(lái)越受到人們的重視。

除骨形成作用外，OB還參與OC骨吸收活性的調(diào)節(jié)[2-4]，在RANK/RANKL/OPG信號(hào)通路中，OB分泌的RANKL可識(shí)別OC前體細(xì)胞表面的RANK并與之結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)骨吸收信號(hào)以調(diào)節(jié)OC前體細(xì)胞的增殖和成熟。另外OB分泌產(chǎn)生的OPG可與RANK競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RANKL，從而防止骨的過(guò)度吸收，可見OB的數(shù)量和活性將直接決定骨量及骨密度[4-6]，提高OB的細(xì)胞數(shù)量和成骨活性在骨質(zhì)疏松防治中尤為關(guān)鍵。

課題組前期研究表明，羊骨髓肽(marrow peptides，MP)及其鈣螯合物(MP-Ca)對(duì)去卵巢大鼠均具有明顯的骨質(zhì)改善作用，且比雌激素更安全[7]。在抗骨質(zhì)疏松新藥篩選和藥效學(xué)評(píng)價(jià)中，體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞是一種重要模型[2,8]。為進(jìn)一步揭示MP、MP-Ca改善骨質(zhì)的機(jī)制，本研究通過(guò)體外試驗(yàn)探究二者對(duì)成骨細(xì)胞增殖及活性影響，并將二者的效果進(jìn)行比較，為研發(fā)更安全、更有效的OP防治藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Tensor 27型傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker光譜儀器公司)、MC721酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上海箐華科技儀器有限公司)、Ⅱ型膠原酶(Sigma)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(HyClone)、100× 青霉素鏈霉素混合液(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)、胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、17β-雌二醇(Sigma)、牛血清白蛋白(BSA Solarbio)、Trition-X100(Sigma)、Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁)、堿性磷酸酶(ALP)測(cè)試盒及總蛋白定量測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)、Rat BGP ELISA Kit(上海橋杜生物科技有限公司)。羊骨髓肽(內(nèi)蒙古錫盟肽好生物制品責(zé)任有限公司生產(chǎn))中的蛋白質(zhì)含量為96%(以干基計(jì))，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中加入10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素混合液制得完全培養(yǎng)基。

1.2 羊骨髓肽鈣螯合物(MP-Ca)的制備及鑒定

以羊骨髓肽(sheep bone marrow peptide，MP)和氯化鈣為原料制備MP-Ca。螯合工藝為[8]：MP濃度89.28 mg·mL-1、肽鈣質(zhì)量比2∶1、pH8.1、40 ℃螯合30 min、8倍體積乙醇靜置沉淀3 h(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%)，8 000 r·min-1離心10 min，沉淀再經(jīng)真空冷凍干燥(-26 ℃預(yù)凍，工作壓強(qiáng)90～100 Pa，升華溫度45～55 ℃)制得MP-Ca，經(jīng)測(cè)定MP-Ca中的鈣含量為(9.05±0.36)%。用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1波段內(nèi)對(duì)樣品粉末進(jìn)行掃描以確定MP-Ca的形成。

1.3 新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞的分離和純化

無(wú)菌條件下，將出生24 h內(nèi)的SD大鼠[山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供SCXK(晉)2015-0001]脫頸處死，采集顱骨，PBS沖洗后剪碎，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液中消化25 min，收集消化液，組織中添加0.1% Ⅱ型膠原酶繼續(xù)消化1 h，收集消化液，合并2次消化液，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移至25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)，培養(yǎng)物每隔0.5 h轉(zhuǎn)至另一培養(yǎng)瓶中，重復(fù)2～3次，以除去大部分成纖維細(xì)胞而獲得原代成骨細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁融合后，以0.25%胰蛋白酶溶液消化，傳代3次獲得純度高、穩(wěn)定性好的成骨細(xì)胞[9-10]。

1.4 成骨細(xì)胞的鑒定

通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、茜素紅染色及堿性磷酸酶(ALP)細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)“1.3”純化獲得的成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定[11-12]。

1.5 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制及各受試物最佳作用濃度的確定

將生長(zhǎng)良好的第三代成骨細(xì)胞以1×104個(gè)·孔-1的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔含完全培養(yǎng)基100 μL，37 ℃培養(yǎng)至貼壁后每天換液。用CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線時(shí)，每天取5孔進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)7 d，測(cè)定時(shí)棄掉舊培養(yǎng)液，每孔加90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液，避光孵育4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm[13]。確定MP、MP-Ca對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響時(shí)，根據(jù)生長(zhǎng)曲線，將到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間確定為CCK-8法檢測(cè)時(shí)間。確定各受試物的最佳作用濃度時(shí)，每孔的接種濃度均為1×104，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，每天換液時(shí)在完全培養(yǎng)基中加入不同濃度的受試物進(jìn)行培養(yǎng)，在之前確定的檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，OD450 nm最大值所對(duì)應(yīng)的濃度即為每種受試物的最佳作用濃度。

1.6 MP、MP-Ca對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

向96孔板內(nèi)已經(jīng)貼壁的成骨細(xì)胞中加入100 μL 完全培養(yǎng)基(對(duì)照組)或含有最佳作用濃度受試物的完全培養(yǎng)基，繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，方法同“1.5”。

1.7 成骨細(xì)胞骨鈣素(BGP)含量及堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定

將成骨細(xì)胞以1×104濃度接種到24孔板上，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)，貼壁后換用添加了最佳作用濃度MP或MP-Ca的完全培養(yǎng)液，每天換液，培養(yǎng)72 h后用0.1%Triton X-100裂解30～40 min，吸取4 μL細(xì)胞裂解液測(cè)定總蛋白濃度，其他裂解液1 000 r·min-1離心5 min，取30 μL上清液用于BGP含量和ALP活性的測(cè)定，按照ALP試劑盒和大鼠BGP ELISA試劑盒的操作步驟進(jìn)行。ALP的活性通過(guò)總蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化，表示為King-Armstrong Unit·g-1。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，折線圖、柱狀圖由SigmaPlot 10.0軟件繪制。

2 結(jié) 果

2.1 羊骨髓肽鈣螯合物(MP-Ca)的鑒定

如圖1所示，MP和MP-Ca的紅外光譜圖波形一致但未完全重疊，吸收峰發(fā)生了明顯的位移變化。

圖1 羊骨髓肽(MP)與羊骨髓肽鈣螯合物(MP-Ca) 紅外光譜圖Fig.1 The infrared spectrum of short peptide with MP and MP-Ca

對(duì)紅外光譜圖進(jìn)一步分析，結(jié)果如表1所示，說(shuō)明鈣離子主要與骨髓肽游離氨基端的氨基(-NH2)、游離羧基端的羧基(-COOH)以及肽鏈內(nèi)部的羰基(C=O)發(fā)生了結(jié)合，通過(guò)螯合，羊骨髓肽變成了羧酸鹽和銨鹽。

表1羊骨髓肽與鈣離子螯合前后紅外光譜分析

Table1Changesofinfraredspectrabeforeandaftercalciumchelatingofbovinebonemarrowoligopeptide

紅外吸收峰Infrared absorption peaksMP波數(shù)/cm-1Wave number of MPMP-Ca波數(shù)/cm-1Wave number of MP-Ca變化Changes原因分析Reasons官能區(qū)13 289.463 359.19波數(shù)增加,譜帶紅移并變N-H伸縮振動(dòng)即-NH2的Functional area寬,螯合成為銨鹽伸縮振動(dòng)(νN-H)23 073.49消失COO-對(duì)稱振動(dòng)32 960.742 973.07波數(shù)增大,發(fā)生藍(lán)移C=O伸縮振動(dòng)(νC=O)41 651.961 624.58波數(shù)減小COO-伸縮振動(dòng)51 452.35消失COO-對(duì)稱振動(dòng)61 400.791 417.19波數(shù)增大COO-對(duì)稱振動(dòng)指紋區(qū)71 162.69消失COO-由伸縮振動(dòng)變成了變形振動(dòng)Fingerprint area81 082.43紅移,譜帶變寬9878.96新增加單鍵的伸縮振動(dòng),變形振動(dòng)10663.18消失11555.26570.84紅移,波數(shù)增加

2.2 成骨細(xì)胞的鑒定

分離的原代成骨細(xì)胞經(jīng)HE染色后，可見細(xì)胞呈短梭形、三角形、多邊形、鱗片狀、鋪路石狀等成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，符合成骨細(xì)胞的特征[11-12]，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富且呈淡紅色，細(xì)胞核呈卵圓形，大而清晰(圖2A)。第三代成骨細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶染色后，視野內(nèi)可見大量陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量黑褐色顆粒(圖2B)；茜素紅與鈣離子螯合形成可紫紅色或紅色復(fù)合物，第三代成骨細(xì)胞經(jīng)茜素紅染色后在細(xì)胞表面形成紅染的鈣化結(jié)節(jié)(圖2C)。

A.經(jīng)HE染色的原代成骨細(xì)胞；B.經(jīng)堿性磷酸酶(ALP)染色的第三代成骨細(xì)胞；C.經(jīng)茜素紅染色的第三代成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)A. HE-stained primary cultured osteoblasts; B. Osteoblasts stained by alkaline phosphatase; C. Calcified nodules on the surface of osteoblasts after Alizarin Red staining圖2 從新生大鼠顱骨細(xì)胞中分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞(×100)Fig.2 Identificationof osteoblasts isolated from neonatal rat calvarial cell (×100)

2.3 MP、MP-Ca對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響

由生長(zhǎng)曲線(圖3A)可知，第三代成骨細(xì)胞貼壁后第1天內(nèi)經(jīng)過(guò)短暫的適應(yīng)期，第2天便進(jìn)入指數(shù)增殖期，5 d之后進(jìn)入穩(wěn)定期，此后細(xì)胞數(shù)目基本穩(wěn)定。因此，確定受試物最佳作用濃度時(shí)選擇OB貼壁后的第5天進(jìn)行檢測(cè)。由圖3B、C可知完全培養(yǎng)液中添加不同濃度的受試物，第5天檢測(cè)時(shí)，MP、MP-Ca均在103μg·mL-1濃度下OD450 nm值最高，細(xì)胞數(shù)量最多，故確定此濃度為MP、MP-Ca的最適作用濃度。同理，雌激素最適作用濃度為102μg·mL-1。圖3D中的測(cè)定結(jié)果經(jīng)方差分析，相同的接種密度，在最適濃度下，雌激素、MP-Ca和MP組的OD450 nm在整個(gè)檢測(cè)期均高于空白組(P<0.05)，且MP-Ca組的OD450 nm顯著高于MP組(P<0.05)，在第4天時(shí)，甚至高于雌激素組(P<0.05)。

A.成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；B、C.不同受試物最適濃度的選擇；D.不同受試物對(duì)成骨細(xì)胞增殖情況的影響A. The growth curve of cultured osteoblasts; B, C. Selection of optimal concentration for each treatment group; D. Effects of different treatment groups on the proliferation of osteoblasts圖3 各處理組最適濃度的選擇及其對(duì)成骨細(xì)胞增殖情況的影響Fig.3 Selection of optimal concentration for each treatment group and the effect of them on the growth curve of osteoblasts

以上結(jié)果說(shuō)明MP-Ca和MP表現(xiàn)出雌激素樣作用，均可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，且與MP相比，MP-Ca促進(jìn)作用更顯著(P<0.05)。

2.4 MP、MP-Ca對(duì)成骨細(xì)胞成骨活性的影響

由圖4可知，MP及MP-Ca處理成骨細(xì)胞后，細(xì)胞裂解液中的ALP活性及BGP含量盡管極顯著低于雌激素組(P<0.01)，但均極顯著高于空白組(P<0.01)；且MP-Ca處理組的ALP活性及BGP含量均極顯著高于MP處理組(P<0.01)。

3 討 論

受集約化養(yǎng)殖過(guò)程中飼養(yǎng)管理方式、日照、飼料配比、激素和抗生素應(yīng)用、重金屬污染等問(wèn)題的影響，骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)對(duì)畜禽健康及動(dòng)物福利的影響逐漸引起社會(huì)關(guān)注[6,14-15]。研究表明，OP發(fā)生時(shí)，機(jī)體的抗氧化水平下降，免疫功能下降，肝、腎、甲狀腺等組織表現(xiàn)出病理變化[16-17]。過(guò)去20年來(lái)，抗骨吸收藥物一直被作為治療OP的首選，但由于骨吸收與骨形成緊密相關(guān)，在抑制骨吸收時(shí)，骨形成的減少也不可避免[18-22]，因而促進(jìn)骨形成的更安全有效的OP防治藥物的研發(fā)日益受到人們的重視。

動(dòng)物來(lái)源的多肽及其鈣螯合物的生物利用度高、安全性好，被證實(shí)可促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)發(fā)育、提高骨密度、恢復(fù)骨質(zhì)疏松大鼠骨骼微觀結(jié)構(gòu)，具有OP防治作用，同時(shí)還具有促進(jìn)免疫、抗氧化等功能，廣受關(guān)注而不斷被開發(fā)[23-26]。但其對(duì)骨質(zhì)的改善作用的相關(guān)研究大都集中效果驗(yàn)證方面，集中在受試物對(duì)血液生化指標(biāo)和骨骼指標(biāo)的影響方面，對(duì)作用機(jī)制方面，例如對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和成骨活性的影響報(bào)道極少。

大寫字母和小寫字母分別代表0.01水平和0.05水平差異顯著，字母相異表示差異顯著，相同表示差異不顯著Capital letters and lower case letters present significant level α=0.05, and α=0.01. Different letters indicate statistic differences between the treatments, same letters mean no significant differences圖4 各受試物對(duì)第三代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性及骨鈣素(BGP)含量的影響Fig.4 Effect of tested agents on the activity of alkaline phosphatase and BGP content of third generation osteoblasts

作為生物體的主要組成部分，骨組織內(nèi)始終進(jìn)行著由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收組成的骨轉(zhuǎn)換過(guò)程。OB作為調(diào)控骨吸收的中心細(xì)胞[5]，其增殖分化活動(dòng)受到抑制是骨質(zhì)疏松癥的主要原因[7]。成骨細(xì)胞的數(shù)量與活性將直接決定最終的骨形成量[2]。

在骨代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種生化標(biāo)志物，其中堿性磷酸酶(ALP)是參與骨代謝的重要蛋白質(zhì)，既可代表成骨細(xì)胞的早期分化水平，又代表著骨形成。同樣，骨鈣素(BGP)在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中產(chǎn)生，是骨礦化不可或缺的重要因子[27]。

經(jīng)紅外光譜鑒定，MP與CaCl2發(fā)生了螯合，形成了羊骨髓肽羧酸鹽和銨鹽[28]，其螯合部位與其他肽鈣螯合物相同[26,29]。MP-Ca和MP均可增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖活性、成骨細(xì)胞裂解液中的ALP活性和BGP含量，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的成骨活性，且同質(zhì)量濃度MP-Ca的效果優(yōu)于MP，所以MP-Ca中Ca2+的螯合摻入，不僅可降低MP的用量，還可使效果增強(qiáng)，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

體外研究表明，效果雖不及雌激素，MP和MP-Ca均可促進(jìn)OB的增殖并增強(qiáng)其骨形成活性，且MP-Ca效果優(yōu)于MP。