韓 杰，熊顯榮，王 艷，楊顯英，阿果約達，黃向月，李 鍵

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)生活在中國高原地區(qū)，能夠適應(yīng)高寒、缺氧的生態(tài)環(huán)境，能充分利用高原地區(qū)天然草地為人們提供優(yōu)質(zhì)健康的食品。此外，牦牛在動物基因遺傳資源研究中也是一個極其珍貴的基因庫，在自然繁殖的牦牛群中，牦牛的繁殖力僅為30%～40%。近些年,雖然對牦牛育種的研究不斷深入，并取得了較大的進展[1]。牦牛繁殖力低的問題嚴重阻礙了牦牛業(yè)及高原地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展。因此，牦牛繁殖性能的研究對提高牧區(qū)人們的生活水平和豐富中國遺傳資源多樣性具有重大意義[2]。

組蛋白去甲基化酶1A(lysine-specific histone demethylase 1A)是一種黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性單胺氧化酶，是胺氧化酶家族中的一員，其主要包括Tower、SWIRM和胺氧化酶3個結(jié)構(gòu)域[3-4]。同時，KDM1A介導(dǎo)的是H3K4me1/2和H3K9me1/2去甲基化作用[5]。對該基因的研究發(fā)現(xiàn)，KDM1A在哺乳動物組織中普遍表達，并且可通過抑制或激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，來調(diào)控DNA損傷、還原轉(zhuǎn)錄子的活性以及紡錘體和染色體的缺失，進而在多種生物體的生殖細胞系中發(fā)揮重要作用[6-11]。此外，該基因同樣參與了細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)、機體造血的調(diào)控以及性激素受體介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程[6,12-16]，由此可知，KDM1A基因在哺乳動物生殖發(fā)育調(diào)控、造血系統(tǒng)、多能干細胞的調(diào)控及內(nèi)分泌等相關(guān)生物學(xué)活動的調(diào)節(jié)中均起重要作用。

關(guān)于KDM1A基因的研究主要集中在人和動物的生長發(fā)育及腫瘤等相關(guān)疾病上[17-19]，而該基因在牦牛上的研究未見相關(guān)報道。為進一步研究KDM1A基因在牦牛睪丸中的表達情況，本研究克隆牦牛KDM1A基因，并對KDM1A序列的蛋白結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)功能進行分析和預(yù)測；應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測牦牛KDM1A基因在睪丸中的表達情況，為進一步研究牦牛的KDM1A基因及其在牦牛生殖生理過程中所發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Trizol Reagent購自Invitrogen(美國)公司，SYBRTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒、PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix TaqTMDNA聚合酶、pMDTM19-T載體均購自TaKaRa(大連)公司，感受態(tài)細胞DH5α購于天根生化科技有限公司，DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司，其他無特殊說明均為國產(chǎn)分析純；熒光定量PCR儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Biodine Rad公司。

1.2 牦牛組織樣本采集

樣本均采自成都青白江屠宰場，無菌采集健康牦牛(4～5歲)的不同組織：心、脾、肝、卵巢、肺、大腦、腎、子宮、睪丸、胃、大腸；采集胎牛(5～6月)、幼年時期(1～2歲)、性成熟時期(4～5歲)、老年時期(9～10歲)牦牛睪丸組織。所需樣本均采集3頭，保存于液氮中。

1.3 牦牛組織總RNA的提取及其完整性檢測

Trizol法提取樣本RNA，對所提取的RNA使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測，結(jié)果顯示，兩條以上亮條帶，且無彌散和拖帶的現(xiàn)象，表明所得RNA完整性很好。應(yīng)用核酸分析儀檢測濃度和OD值，選取OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0的RNA作為模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，使用GAPDH基因的特異性引物檢測cDNA的質(zhì)量，對瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示單一清晰條帶的cDNA進行編號，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計及合成

根據(jù)NCBI已報道的野牦牛(Bosmutus)KDM1A(GenBank登錄號：XM_005905175.2)和GAPDH基因mRNA序列(GenBank登錄號：AC_000162.1)，使用Primer 5.0分別設(shè)計引物(表1)。由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 目的基因的擴增與克隆

PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中Premix TaqTMDNA聚合酶12.5 μL， cNDA 1.0 μL， ddH2O 9.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL。PCR擴增條件： 94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性45 s， 58 ℃退火1 min(3段的退火溫度分別為62.2、56.4和53.0 ℃),72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，紫外光下切取目的條帶并按照膠回收試劑盒說明書回收目的DNA。然后將回收產(chǎn)物與pMDTM19-T載體在16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中。將菌液均勻涂于LB固體培養(yǎng)基(AMP+)平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機挑去單菌落，在搖床震蕩培養(yǎng)8 h，以菌液為模板進行PCR鑒定，將呈陽性結(jié)果的菌液，送上海生物工程有限公司測序。

表1引物信息

Table1Primerinformation

基因Gene引物序列(5′→3′)Primer sequence退火溫度/℃Tm產(chǎn)物長度/bpProduct size用途UtilizationKDM1A-1F1:GTCCCTGGGTCTGCGACC62.2674KMD1A cDNA擴增R1:GCTGCTGCCAAGCCTGAGAmplification of cDNA of KDM1AKDM1A-2F2:TGGTCTTATCAACTTCGGCATC56.41 167KDM1A cDNA 擴增R2:GGAAGAGGCGGCACAAACTAmplification of cDNA of KDM1AKDM1A-3F3:TCAGGGTGCGAAGTGATAG53.0817KDM1A cDNA 擴增R3:TATGCAGCCAAAGACACGAmplification of cDNA of KDM1AGAPDHF:TGCTGGTGCTGAGTATGTGGTG60.0293內(nèi)參基因擴增 R:TCTTCTGGGTGGCAGTGATGGAmplification reference genesKDM1AF4:GATACTGTGCTTGTCCACCGAG60.0245實時熒光定量PCRR4:GGATTCCCTCCAAGACCTGTTACReal time quantitative PCR

F.正向引物；R.反向引物

F.Forword primer; R.Reverse primer

1.6 牦牛KDM1A基因生物信息學(xué)分析

NCBI中ORF Finder分析KDM1A序列的開放閱讀框，并獲得氨基酸序列，BLAST在線工具進行同源性比對；使用在線軟件Protparam、ProtScale(理化性質(zhì)、疏水性)、SignalP(信號肽)、TMHMM(跨膜區(qū))、NetPhos(磷酸化位點)、SOPMA、SWISS-MODEL(二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu))對KDM1A蛋白進行生物信息學(xué)分析；在NCBI中找到需要建樹的相關(guān)物種該基因序列，并利用MEGA 5.0軟件進行比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.7 牦牛KDM1A基因組織表達譜檢測

采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)檢測KDM1A基因在牦牛心、脾、肝、卵巢、肺、大腸、大腦、腎、子宮、睪丸、胃中的表達。RT-qPCR反應(yīng)體系為15 μL，其中SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，cNDA 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)，重復(fù)3次。

1.8 牦牛睪丸組織中KDM1A基因表達分析

采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)檢測不同時期牦牛睪丸中KDM1A基因的表達。RT-qPCR反應(yīng)體系同1.7。每個樣本進行3次重復(fù)，用2-△△Ct法對定量結(jié)果進行分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

熒光定量結(jié)果用“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示。采用SPSS軟件進行顯著性分析，P<0.01差異極顯著，P>0.05差異不顯著，P<0.05差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 樣本RNA完整性檢測

用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，結(jié)果顯示，所提組織RNA均出現(xiàn)兩條清晰明亮的條帶(18S和28S)，且無彌散和拖帶的現(xiàn)象，無蛋白和DNA等雜質(zhì)的污染，表明所得RNA完整性很好(圖1)。

1.肝；2.睪丸；3.心；4.脾；5.肺；6.大腸；7.卵巢；8.腎；9.子宮；10.大腦；11.胃；12.胎牛睪丸；13.幼年期睪丸；14.老年期睪丸1.Liver; 2. Testis; 3. Heart; 4. Spleen; 5. Lung; 6. Large intestines; 7. Ovary; 8. Kidney; 9. Uterus; 10. Cerebrum; 11.Stomach; 12. Fetal bovine testis; 13. Juvenile testis; 14. Senile testis圖1 各組織RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Result of agarose gel electrophoresis of different tissues RNA

2.2 牦牛KDM1A基因CDS擴增及克隆測序

以牦牛睪丸組織的總RNA為模板，利用RT-PCR對KDM1ACDS區(qū)進行擴增，得到單一清晰條帶(圖2)，并使用DNAMAN對所得序列進行拼接。獲得核苷酸序列為2 401 bp(圖3)，開放閱讀框為2 331 bp，共編碼776個氨基酸。

M.DL2000 DNA marker；1～3. KDM1A-1、 KDM1A-2、 KDM1A-3的PCR產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker; 1-3.The PCR products of yak KDM1A-1, KDM1A-2, KDM1A-3圖2 牦牛KDM1A基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 Result for PCR amplification of yak KDM1A

2.3 物種間KDM1A基因同源性比較及進化樹構(gòu)建

將克隆測序的牦牛KDM1A基因與黃牛(XM_005203319.1)、野牦牛(XM_005905175.2)、綿羊(XM_012152442.2)、山羊(XM_995676880.3)、野豬(NM_001112687.1)、駱駝(XM_010979844.1)、人(KJ_904681.1)、犬(XM_022413506.1)、貓(XM_019836867.1)、馬(XM_014737273.1)、家鼠(NM_001356567.1)、兔(XM_008265704.2)、原雞(XM_015297587.1)、非洲爪蟾(XM_002936594.4)進行比對，同源性分別為99.6%、99.7%、97.6%、97.6%、93.6%、93.8%、90.9%、93.0%、92.9%、93.0%、89.4%、89.5%、81.5%、77.9%。隨后對15個物種KDM1A基因進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，結(jié)果表明，該基因在物種進化過程中有很高的保守性，其中與牦牛KDM1A基因親緣關(guān)系最近的是野牦牛，其次是黃牛、綿羊、山羊等(圖4)。

2.4 牦牛KDM1A蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

采用ExPASY在線工具分析KDM1A蛋白的理化性質(zhì)，該蛋白分子質(zhì)量為85.96 ku，分子式C3823H6038N1052O1155S23，等電點5.82，脂肪系數(shù)84.21，半衰期30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為41.46，帶負電殘基數(shù)(Asp + Glu) 97，帶正電殘基數(shù)(Arg + Lys) 85。推測該蛋白可能是不穩(wěn)定的酸性蛋白。出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基有Glu(8.1%)、Val(7.1%)、Leu(9.9%)、Ala(8.4%)，且不包括吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。疏水性預(yù)測分析，KDM1A蛋白親水性分值在第15位最小為-3.144，第628位最大為2.656，總平均親水性-0.378<0，且較大多數(shù)氨基酸殘基具有親水性，推測為親水性蛋白，與所分析的蛋白理化性質(zhì)結(jié)果一致。SignalP、TMHMM分析表明，KDM1A蛋白為不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽的蛋白。蛋白修飾磷酸化位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白有31個Ser位點，28個Thr位點和14個Tyr位點。KDM1A蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測知，295個α-螺旋占38.02%，64個β-轉(zhuǎn)角占8.25%，271個無規(guī)卷曲占34.92%，146個延伸鏈占18.81%(圖5)，同時該蛋白的三級結(jié)構(gòu)進一步驗證了二級的預(yù)測。

上行表示牦牛KDM1A基因核苷酸序列；下行表示推測的氨基酸序列；下劃線表示突變堿基；*表示終止密碼子The upper lines show the nucleotide sequences and the lower lines show the deduced amino acid sequences.Base mutations are underlined;* shows termination codon圖3 牦牛KDM1A基因核苷酸及其推測的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequences and the deduced amino acid sequences of yak KDM1A

2.5 牦牛KDM1A基因的組織表達譜

以內(nèi)參基因GAPDH作為參照，利用RT-qPCR檢測KDM1A基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、小腸、卵巢、子宮、胃、睪丸、大腦組織中表達，結(jié)果顯示，其在牦牛各組織中普遍表達，但仍存在差異，其中該基因在睪丸和肝中的表達相對較高，心和卵巢中的表達次之，脾、肺、腎、子宮、大腦、大腸、胃中的表達相對較低(圖6)。

2.6 牦牛不同發(fā)育時期睪丸中KDM1A基因的表達

以內(nèi)參基因GAPDH作為參照，利用RT-qPCR檢測KDM1A基因在牦牛不同時期睪丸中mRNA的表達情況(圖7)。結(jié)果顯示，KDM1A基因從胎牛～老年期睪丸中表達水平呈明顯的先上升后下降趨勢，以胎牛時期該基因的表達量作為參考，幼年和老年期約為胎牛時期的15倍(P<0.01)；以幼年期的作為參考，該基因在性成熟時期的表達量顯著高于幼年期，約為其表達量的1.6倍(P<0.05)，與老年期睪丸中KDM1A的表達水平差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同物種間的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of KDM1A of various species

圖5 牦牛KDM1A蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Tertiary structure prediction of KDM1A protein of yak

3 討 論

KDM1A是位于細胞核上的一種黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性單胺氧化酶，是胺氧化酶家族中的一員。KDM1A主要催化H3K4me1/2和H3K9me1/2的去甲基化，并且可通過調(diào)控相關(guān)基因表達來介導(dǎo)精子的發(fā)生過程[20]。本研究克隆獲得牦牛KDM1A基因核苷酸序列，與野牦牛對比，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)除了存在4處堿基突變，使編碼區(qū)第28位、35位、223位氨基酸，變化由K→T，D→G，R→I，還發(fā)現(xiàn)從250 bp開始，比野牦牛多出了連續(xù)的60 bp堿基，導(dǎo)致多編碼20個氨基酸，依次是SGQAGGLQDDSSGGYGDGQA。但這種氨基酸的突變是否會導(dǎo)致蛋白功能改變，有待深入的研究。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與野牦牛、黃牛的同源性最高，暗示牦牛KDM1A基因在進化過程中具有較高的保守性。

組織間比較：不同字母代表差異顯著(P<0.05)Comparison among tissues: Different letters show significant differences(P<0.05)圖6 KDM1A基因在牦牛不同組織中的表達Fig.6 The expression of KDM1A in yak different tissues

與胎牛比較：**.差異極顯著(P<0.01)；*.差異顯著(P<0.05)Comparison with fetal bovine: ** show very significant difference(P<0.01)，* show significant differences(P<0.05)圖7 KDM1A基因在牦牛不同發(fā)育時期睪丸中的表達水平Fig.7 The expression of KDM1A in different growth periods of yak testis

組織表達譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因mRNA在所選牦牛組織中均有表達，這與文獻[8]的結(jié)果一致，且其表達量在睪丸、肝中較高，在睪丸中表達量高的原因可能和其在調(diào)控精子形成過程中起重要作用有關(guān)[20]。其在肝中表達量較高可能是和Wnt信號通路調(diào)節(jié)肝干細胞增殖、分化以及谷氨酰胺新陳代謝作用相關(guān)。已有研究證明，Wnt/β-Catenin信號通路在肝的發(fā)育、再生、新陳代謝以及氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮著重要作用，其中編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)運體(參與谷氨酰胺新陳代謝活動的酶)基因的表達受該通路的調(diào)控作用。敲減KDM1A可解除Wnt信號通路的抑制，進一步調(diào)控與該通路相關(guān)基因的表達[21-24]。

睪丸是產(chǎn)生雄激素、精子的重要場所，其包括不同發(fā)育階段的生精細胞、支持細胞和分泌雄性激素以維持雄性功能和促進精子形成的間質(zhì)細胞等多種功能各異的細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，KDM1A可通過調(diào)控相關(guān)基因的表達活性來介導(dǎo)精原干細胞的維持和分化過程，進而在精子發(fā)育和形成過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[21]。

本試驗采用實時熒光定量PCR的方法檢測了該基因在不同發(fā)育時期牦牛睪丸中的表達差異。結(jié)果表明，KDM1AmRNA在不同時期睪丸中均有表達，但其表達量存在差異，表明KDM1A基因在睪丸發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用。胎牛(5～6月)時期的睪丸僅有少量支持細胞、未分化的精原干細胞，出生后，隨著年齡增長，性成熟后(3～4歲)的牦牛睪丸較幼年期(1～2歲)的變化較大，主要包括間質(zhì)細胞數(shù)量、生精上皮和生精細胞數(shù)量種類以及生精細胞層的明顯增厚、增多[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體多存在于間質(zhì)細胞和支持細胞，同時，KDM1A可與該受體結(jié)合，調(diào)控其依賴性基因的表達，進一步介導(dǎo)睪丸發(fā)育以及睪酮調(diào)控精子發(fā)生的過程。因此，隨著幼年牦牛步入性成熟，其睪丸內(nèi)的間質(zhì)細胞增多，迫使了更多的雄激素受體激活以便于睪丸的正常發(fā)育以及保證精子的發(fā)生過程的順利進行[26-27]。綜上表明，KDM1A在精子發(fā)生的分化過程發(fā)揮著重要功能。因此，從胎牛(出生前)～性成熟(3～4歲)的不同時期，KDM1A表達量呈顯著上升趨勢。這一變化主要和睪丸發(fā)育過程中間質(zhì)細胞以及生精細胞種類和數(shù)量增多有關(guān)，也是精子發(fā)生所必須的變化趨勢。然而隨著年齡增長，生精功能逐漸下降，生精細胞層數(shù)也明顯減少，精原細胞、精母細胞和精子細胞均有不同程度的減少，精子細胞數(shù)明顯減少，老年期較性成熟時期的KDM1A表達量又顯著下降。由此推測，KDM1A基因可能參與了牦牛睪丸發(fā)育過程。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了牦牛KDM1A序列。生物信息學(xué)分析表明，KDM1A基因CDS區(qū)的保守性較高。同時，KDM1A基因在牦牛不同發(fā)育時期睪丸中的表達規(guī)律表明，該基因可能參與牦牛睪丸的發(fā)育。此結(jié)果為進一步研究KDM1A基因?qū)﹃笈Ｉ硻C能的調(diào)控提供基礎(chǔ)資料。