鐘純燕，李基棕，毛 立，李文良，郝 飛，孫 敏，劉茂軍，主 性，嵇辛勤，肖 芳，楊蕾蕾，張紋紋

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014；2. 臨沂大學(xué) 藥學(xué)院，臨沂 276000； 3. 貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus type 3, CPIV3)屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬的新成員，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。同屬成員還包括人副流感病毒1型和3型(human PIV1、human PIV3)、仙臺(tái)病毒(Sendai virus, SV)和牛副流感病毒3型(bovine PIV3)[1]。2013年起在江蘇、安徽等地的山羊養(yǎng)殖場(chǎng)中檢測(cè)到CPIV3，感染羊出現(xiàn)不同程度的呼吸道疾病，RT-PCR擴(kuò)增測(cè)序其N、M、F和HN基因發(fā)現(xiàn)，這些基因與HPIV1和HPIV3的相似性僅為76.9%～83.5%[2-4]。隨后本實(shí)驗(yàn)室將分離鑒定的CPIV3 JS2013株進(jìn)行山羊致病性試驗(yàn)，結(jié)果得出，CPIV3感染的山羊出現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、發(fā)熱和精神沉郁等臨床癥狀，并出現(xiàn)持續(xù)性的病毒血癥和排毒，剖檢可見(jiàn)肺和氣管出現(xiàn)較嚴(yán)重的病理?yè)p傷，并且CPIV3能通過(guò)氣溶膠水平傳播，使相鄰圈舍健康羊出現(xiàn)呼吸道癥狀，并可檢出病毒血癥和排毒[5]，這給養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展帶來(lái)了新的威脅。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用建立的熒光定量RT-qPCR方法[6]和阻斷ELISA方法[7]對(duì)采集的鼻拭子和血清進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CPIV3病原核酸檢出率達(dá)44.7%，抗體檢出率達(dá)39.3%。因此，該病原對(duì)養(yǎng)羊業(yè)的危害應(yīng)該引起足夠的重視。

miRNA(microRNA)是一類長(zhǎng)度為19～24 nt的非編碼RNA，細(xì)胞內(nèi)源性miRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結(jié)合，通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合靶mRNA的5′非編碼區(qū)(5′ untranslated regions, 5′UTR)、3′UTR或編碼區(qū)堿基，可降解mRNA或抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，從而參與細(xì)胞分化、增殖、代謝及凋亡的各個(gè)環(huán)節(jié)，與動(dòng)物機(jī)體生殖發(fā)育、腫瘤形成及病毒感染過(guò)程密切相關(guān)[8-9]。近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛參與宿主體內(nèi)的抗病毒作用，miR-122可與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)基因組的5′UTR互補(bǔ)結(jié)合來(lái)調(diào)控病毒增殖，因此miR-122在肝細(xì)胞中的表達(dá)能有效降低HCV復(fù)制水平[10-11]。miR-130在體內(nèi)外具有抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染作用，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)揭示PRRSV的5′UTR是miR-130調(diào)控的靶位點(diǎn)[12]。金屬蛋白酶m41 ftsh是西尼羅河病毒(West Nile virus, WNV)復(fù)制的必需因子，aae-miR-2940-5p能增強(qiáng)該蛋白酶的基因轉(zhuǎn)錄，提高病毒的復(fù)制效率[13]。

在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室使用CPIV3感染MDBK細(xì)胞，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)篩選出感染細(xì)胞和正常細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-222在CPIV3感染細(xì)胞樣品中出現(xiàn)顯著下調(diào)、GO注釋和KEGG富集，miR-222調(diào)控的靶基因(interferon regulatory factor 2, IRF2)參與天然免疫通路，且IRF2是IFN信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子[14]。因此過(guò)表達(dá)的miR-222可能會(huì)促進(jìn)IFN的表達(dá)，抑制病毒增殖。為挖掘具有抗CPIV3增殖作用的miRNA，本研究將miR-222在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)，探討miR-222對(duì)CPIV3復(fù)制的影響及其機(jī)制，以期為CPIV3的防控提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒與主要試劑

CPIV3 JSHA2014-1 MDBK細(xì)胞適應(yīng)株為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；MDBK細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；293FT細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit購(gòu)自TaKaRa公司；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix及其他PCR試劑購(gòu)自北京全氏金生物公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；IRF2抗體購(gòu)自Abcam公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因載體pRL-CMV、pGL3-control和Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit均購(gòu)自Promega公司。

1.2 miR-222 mimics和miR-222 inhibitor的設(shè)計(jì)與合成

MiR-222 mimics和miR-222 inhibitor是根據(jù)miR-222的序列(AGCUACAUCUGGCUACU-GGGU)設(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成方法制備。MiR-222 mimics能顯著提高成熟miR-222的表達(dá)；miR-222 inhibitor能特異性與成熟miR-222靶向結(jié)合從而抑制其發(fā)揮作用。兩種miRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3 MiR-222 對(duì)CPIV3復(fù)制的影響

在24孔板中準(zhǔn)備MDBK單層細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%匯合度時(shí)，分別將miR-222 mimics和miR-222 inhibitor轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24 h，每孔接種1 000 TCID50的CPIV3 JSHA2014-1株，1.5 h后棄去病毒液，更換成500 μL 2% DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別在接毒后24和48 h收獲細(xì)胞上清，用RT-qPCR和TCID50法測(cè)定CPIV3病毒含量。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染NC對(duì)照組。

1.4 RT-qPCR和TCID50檢測(cè)CPIV3滴度

用Transzol UP試劑提取上清中的總RNA后，使用TaKaRa公司的One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit檢測(cè)上清中CPIV3核酸含量。使用ABI Step One熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，RT-qPCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用的引物qCPIV3F、qCPIV3R和探針qCPIV3-probe序列見(jiàn)表1。

表1相關(guān)引物序列表

Table1Thesequenceofprimersusedinthisstudy

引物名稱Name序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)功能作用Characteristics參考文獻(xiàn)ReferencesqCPIV3FGCTTGGCTTCTTTGAAATGG熒光定量PCR[6]qCPIV3RGCCTGCAGAAGTTCCTTGTC擴(kuò)增CPIV3 JSqCPIV3-probeFAM-CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA- HA2014-1TAMRAqIRF2-FGCCAAGTTGTGGAGGTG熒光定量PCRIn this study qIRF2-RCACGCTATCCGTAGTTTCA擴(kuò)增IRF2PCR擴(kuò)增效率96.7%qIFN-α-FGTGAGGAAATACTTCCACAGACTCACT熒光定量PCR[15]qIFN-α-RTGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGA擴(kuò)增IFN-αqIFN-β-FCCTGTGCCTGATTTCATCATGA熒光定量PCR[15]qIFN-β-RGCAAGCTGTAGCTCCTGGAAAG擴(kuò)增IFN-βGAPDH-FGATTGTCAGCAATGCCTCCT熒光定量PCR[15]GAPDH-RGGTCATAAGTCCCTCCACGA擴(kuò)增GAPDHIRF2-3′UTR-FGGGGTACCCCKpnⅠAAGATTATGCAAATTCTCAGATPCR擴(kuò)增IRF2In this study 3′UTR IRF2-3′UTR-RGAAGATCTTCBglⅡGAATCTCATGGACAGAGAAGmiR-222 AGCUACAUCUGGCUACUGGGU細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)In this study miR-222miR-222ACCCAGUAGCCAGAUGUAGCU細(xì)胞內(nèi)抑制表In this studyinhibitors達(dá)miR-222miR-222-mutACGAUGUACUGGCUACUGGGU突變miR-222In this studyNCUUCUCCGAACGUGUCACGUTT陰性對(duì)照In this studyNC inhibitorCAGUACUUUUGUGUAGUACAAIRF2-957GCAAACAGUACCUCAGCAAUUIRF2-656GCGGUCCUGACUUCAACUAUURNA干擾In this studyIRF2-213GGCUGGAAGAACAGAUCAAUU

將MDBK細(xì)胞接種96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合度，用維持液將收獲的病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋，然后接種細(xì)胞，每孔100 μL，重復(fù)4個(gè)孔，37 ℃培養(yǎng)3 d，然后觀察每個(gè)稀釋度出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)。按Reed-Muench方法計(jì)算病毒TCID50。

1.5 miR-222調(diào)控CPIV3復(fù)制的分子機(jī)制

1.5.1 miR-222對(duì)IRF2和IFN產(chǎn)生的影響 在24孔板中準(zhǔn)備MDBK單層細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%匯合度時(shí)，將miR-222 mimics轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后收獲細(xì)胞，用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中IFN的mRNA水平。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染NC對(duì)照組。

提取收獲細(xì)胞的總RNA，使用北京全氏金生物公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR檢測(cè)。使用ABI Step One熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算轉(zhuǎn)染miRNA組和轉(zhuǎn)染NC對(duì)照組的IFN轉(zhuǎn)錄量變化，結(jié)果以-ΔΔCt表示。所用的引物qIFN-α-F、qIFN-α-R，qIFN-β-F、qIFN-β-R和GAPDH-F、GAPDH-R見(jiàn)表1。

1.5.2 miR-222靶基因預(yù)測(cè) 用生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)miR-222的靶基因及其結(jié)合位點(diǎn)，并選擇與干擾素信號(hào)通路相關(guān)的靶基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

1.5.3 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析miR-222靶基因 根據(jù)IRF2 mRNA的3′UTR設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)KpnⅠ和BglⅡ酶切位點(diǎn)克隆于熒光素酶報(bào)告載體pGL3-control中，構(gòu)建重組熒光素酶報(bào)告載體pGL3-IRF2 3′UTR。將pGL3-IRF2 3′UTR、pRL-CMV和miR-222 mimics共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分析熒光素酶的變化。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染NC對(duì)照組。

1.5.4 Western blot分析 在24孔板中準(zhǔn)備MDBK單層細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%匯合度時(shí)，將miR-222 mimics轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后收獲細(xì)胞，用Western blot分析IRF2蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染NC對(duì)照組。

1.5.5IRF2基因敲除對(duì)CPIV3復(fù)制的影響 針對(duì)IRF2的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成3條siRNA(si-IRF2)，同時(shí)設(shè)計(jì)并合成siRNA陰性對(duì)照，序列見(jiàn)表1。siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

在24孔板中準(zhǔn)備MDBK單層細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%匯合度時(shí)，將3個(gè)siIRF2同時(shí)轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24 h，每孔接種1 000 TCID50的CPIV3 JSHA2014-1株，1.5 h后棄去病毒液，更換成500 μL 2% DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別在接毒后24和48 h收獲細(xì)胞上清，用RT-qPCR和TCID50法測(cè)定CPIV3病毒含量。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照組。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 MiR-222 對(duì)CPIV3復(fù)制的影響

將合成的miR-222 mimics和miR-222 inhibitor，轉(zhuǎn)染導(dǎo)入MDBK細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)RT-qPCR技術(shù)和TCID50方法來(lái)評(píng)價(jià)CPIV3的復(fù)制能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-222 mimics在24和48 h均能有效抑制CPIV3的增殖(P<0.01)，如圖1所示；轉(zhuǎn)染miR-222 inhibitor在24和48 h均能有效促進(jìn)CPIV3的增殖(P<0.01)，如圖2所示。

2.2 MiR-222對(duì)Ⅰ型干擾素轉(zhuǎn)錄的影響

使用miR-222 mimics轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，24 h后收集MDBK細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中的IFN-α和IFN-β轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-α(P<0.01)和IFN-β(P<0.001)轉(zhuǎn)錄均極顯著上調(diào)，如圖3所示。

2.3 MiR-222的靶基因預(yù)測(cè)及對(duì)靶基因的調(diào)控作用

用TargetScan預(yù)測(cè)miR-222的靶基因及其結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，IRF2基因的3′UTR中存在miR-222的潛在靶序列(3′UTR：977—984 bp)，如圖4所示。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分析熒光素酶變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-222 mimics組的熒光素酶活性與對(duì)照組相比降低55%左右，差異極顯著(P<0.01)，但轉(zhuǎn)染miR-222-mut mimics組的熒光素酶活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P=1)，見(jiàn)圖5A。用RT-qPCR檢測(cè)IRF2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-222 mimics組IRF2 mRNA量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖5B。用Western blot分析IRF2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-222 mimics組IRF2蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，見(jiàn)圖5C。

圖1 MiR-222 mimics對(duì)CPIV3增殖的抑制作用Fig.1 Bta-miR-222 mimics inhibited CPIV3 replication in MDBK cells

圖2 MiR-222 inhibitor對(duì)CPIV3增殖的促進(jìn)作用Fig.2 Bta-miR-222 inhibitor promoted CPIV3 replication in MDBK cells

圖3 IFN-α和IFN-β的轉(zhuǎn)錄變化Fig.3 Bta-miR-222 mimics increase typeⅠinterferon transcription in MDBK cells

2.4 IRF2基因敲除對(duì)CPIV3復(fù)制的影響

將3條si-IRF2同時(shí)轉(zhuǎn)染于MDBK細(xì)胞，24 h后收獲細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)IRF2基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染si-IRF2后IRF2基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6A。Western blot檢測(cè)IRF2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-IRF2后IRF2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，見(jiàn)圖6B。同時(shí)在轉(zhuǎn)染si-IRF2 24 h后接種CPIV3病毒液，24 h后收獲病毒液，RT-qPCR技術(shù)和TCID50檢測(cè)病毒含量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-IRF2組其CPIV3病毒含量極顯著低于NC對(duì)照組(P<0.001)，見(jiàn)圖6C、D。

3 討 論

MiR-222家族分布廣泛且高度保守，其序列在脊椎動(dòng)物中具有極高的同源性。近期學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，miR-222在不同的宿主細(xì)胞中通過(guò)作用于不同的靶基因而發(fā)揮調(diào)控功能。Zeng等[16]、Dai等[17]和Galardi等[18]的研究證實(shí)miR-222能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，其靶基因包括細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑(BCL-2 modifying factor, BMF)基因、蛋白磷酸酶2A和腫瘤抑制因子p27等；Yan等[19]發(fā)現(xiàn)miR-222參與先天性免疫應(yīng)答，調(diào)控的靶基因包括腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6和白介素1β。Cheng等[20]在穩(wěn)定表達(dá)戊型肝炎病毒ORF3的細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，miR-222表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)，ORF3蛋白是啟動(dòng)病毒增殖的調(diào)節(jié)因子，但該團(tuán)隊(duì)沒(méi)有進(jìn)一步探究miR-222是否參與機(jī)體免疫防御。因此，miR-222調(diào)節(jié)病毒增殖作用尚無(wú)人報(bào)道。

圖4 MiR-222的靶基因預(yù)測(cè)Fig.4 Bta-miR-222 directly targets the 3′UTR of IRF2

圖5 MiR-222對(duì)IRF2的調(diào)控作用Fig.5 Bta-miR-222 downregulates IRF2 expression in MDBK cell

圖6 轉(zhuǎn)染si-IRF2對(duì)CPIV3復(fù)制的影響Fig.6 Bta-miR-222 suppress CPIV3 replication through targeting IRF2

基于此，為了證實(shí)MDBK細(xì)胞內(nèi)源性miR-222抗CPIV3免疫作用，本研究通過(guò)合成miR-222類似物和抑制劑，分別轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，24 h后收獲細(xì)胞，以5S rRNA為內(nèi)參，相對(duì)熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-222的表達(dá)量，得出細(xì)胞內(nèi)miR-222含量分別提高或降低2～3倍。接種CPIV3病毒液，24 h后收毒，熒光定量RT-PCR和TCID50的方法來(lái)評(píng)價(jià)CPIV3的復(fù)制能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-222類似物在24和48 h均能有效抑制CPIV3的增殖；同時(shí)，轉(zhuǎn)染相同劑量的miR-222抑制劑在24和48 h均能有效促進(jìn)CPIV3的增殖。結(jié)果說(shuō)明，miR-222具有調(diào)控CPIV3復(fù)制的能力。隨后在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-222，熒光定量RT-PCR顯示，IFN-α和IFN-β轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。IFN能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白的細(xì)胞因子，具有抑制病毒增殖和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的生物學(xué)功能，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IFNmRNA轉(zhuǎn)錄水平，可以用來(lái)評(píng)估機(jī)體免疫系統(tǒng)活化程度[21]。以上結(jié)果說(shuō)明，miR-222通過(guò)誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，抑制CPIV3增殖。

為了進(jìn)一步揭示miR-222調(diào)控Ⅰ型干擾素影響CPIV3復(fù)制的分子機(jī)制，本研究用TargetScan預(yù)測(cè)miR-222的靶基因及其潛在的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，IRF2基因的3′UTR中存在miR-222的潛在靶序列，隨后用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、RT-qPCR、Western blot和RNAi等方法證實(shí)了miR-222對(duì)IRF2的靶向調(diào)節(jié)作用。IRF2是IFN途徑中發(fā)揮抗病毒作用的重要節(jié)點(diǎn)蛋白，其作用是負(fù)向調(diào)節(jié)IFN產(chǎn)生和信號(hào)傳導(dǎo)[22]。而細(xì)胞因子的穩(wěn)定產(chǎn)生在維持機(jī)體免疫反應(yīng)平衡中起關(guān)鍵作用，Hida等[23]揭示了IRF2缺陷型小鼠體內(nèi)IFN產(chǎn)生失調(diào)，從而出現(xiàn)漸進(jìn)性皮炎癥狀。Li等[14]證實(shí)通過(guò)將辛德比斯病毒(Sindbis virus)腦內(nèi)注射IRF2缺陷型小鼠后發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠相比，IRF2缺陷型小鼠IFN調(diào)節(jié)功能紊亂，更利于病毒在體內(nèi)復(fù)制，造成嚴(yán)重的組織損傷和小鼠死亡。在本研究中，miR-222通過(guò)抑制IRF2 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)IFN的產(chǎn)生，提高細(xì)胞天然免疫功能，抑制CPIV3在MDBK細(xì)胞中增殖。

綜上所述，本研究揭示了miR-222影響CPIV3增殖的分子調(diào)控機(jī)制，發(fā)掘了miR-222調(diào)控的Ⅰ型干擾素分子通路，這是研究CPIV3致病機(jī)制新的切入點(diǎn)，也為抗CPIV3分子藥物的研發(fā)提供科學(xué)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

miR-222通過(guò)靶向降解IRF2 mRNA提高IFN表達(dá)水平來(lái)抑制CPIV3復(fù)制。