，，，， ， ，

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600; 2.遼寧省衛(wèi)生計生委，沈陽 110000)

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag.)、龍膽(GentianascabraBge.)、三花龍膽(GentianatrifloraPall.)或堅龍膽(GentianarigescensFranch.)的干燥根及根莖。前三種習(xí)稱“龍膽”，后一種習(xí)稱“堅龍膽”，春、秋二季采挖[1]。中藥龍膽具有清熱燥濕, 瀉肝膽火的功效, 常用于治療濕熱黃疸、帶下、濕疹、瘙癢、脅痛、口苦、驚風(fēng)抽搐等疾病。

遼寧省為我國龍膽栽培大省，主要栽培區(qū)域為遼寧東部山區(qū)，以撫順市清原縣為主，另外新賓縣和本溪市桓仁縣也有栽培。其中遼寧省撫順市清原縣為我國最大的龍膽栽培基地，其栽培品種為粗糙龍膽(GentianascabraBge.)。據(jù)國土資源記載，遼寧省清原縣鹽漬化土地較多，而栽培龍膽主要以種子直播育苗，后移苗至田間。

種子發(fā)育過程實質(zhì)是源器官最初光合產(chǎn)物葡萄糖，向庫器官以葡萄糖、蔗糖等可溶性糖形式運(yùn)輸?shù)倪^程[2]?？扇苄蕴鞘侵饕夂袭a(chǎn)物，是碳水化合物代謝、暫時貯藏和運(yùn)輸?shù)闹饕问?，也是呼吸作用的主要底物。丙酮酸是龍膽有效成分環(huán)烯醚萜類生物合成途徑中重要的前體物質(zhì)。龍膽的主要有效成分為龍膽苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、苦龍膽酯苷等環(huán)烯醚萜類成分，但由于種子萌發(fā)期間獐牙菜苦苷和苦龍膽酯苷積累較少，很難被檢測出來，故本實驗探究龍膽種子萌發(fā)期間可溶性糖、丙酮酸、龍膽苦苷、獐牙菜苷含量的變化規(guī)律。

1 材料與儀器

實驗材料；龍膽種子2017年9月采于撫順市清原縣，為3年成熟種子，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定為龍膽(GentianascabraBge.)種子。

儀器：人工氣候箱(珠江牌 LRH-150-GIS)；紫外分光光度計(島津，UV-1750)；KQ 3200超聲儀；CP 225 D電子天平(德國Sartorius公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀；Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(250×4.6 mm,5μm)；SPD-10 A紫外檢測器，四元梯度泵，柱溫箱。

實驗試劑：甲醇(默克4 L)；娃哈哈純凈水；蒽酮(Q/12 HB 3767-2010)；2,4-二硝基苯肼(T 6303)；蔗糖；丙酮酸(Y 15 J 7 Y 44595);龍膽苦苷(R 04 S 8 F 42886)；獐牙菜苷(P 31 M 7 F 12286)；無水乙醇。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品培養(yǎng)與收集

前期研究成果表明，龍膽種子在鹽分濃度為90 mmol/L時，累計發(fā)芽率小于20%[3]，故本實驗設(shè)計最大濃度為90 mmol/L。將NaCl用去離子水溶解，分別配制成18，36，54，72，90 mmol/L的溶液，以pH=7.0的去離子水為對照組。取適量成熟飽滿種子，先用純凈水浸泡30 min[4]，再用1%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，用流水將殘留的次氯酸鈉溶液沖洗干凈，最后用去離子水沖洗干凈。將9 cm的培養(yǎng)皿用75%乙醇消毒，取成熟飽滿種子適量于放有2層紗布的培養(yǎng)皿中，用注射器吸取上述處理液5 mL于各處理組中。共設(shè)置5個處理組，3個重復(fù)組，一個對照組。放入25 ℃、50% RH、光照9 000 lx的人工氣候箱中(12 h光照/12 h黑暗)。采用稱量法補(bǔ)足每天損失的水分。

每組分別在培養(yǎng)后第2、4、6、8、10、12、15天取出樣品，用去離子水清洗殘留的NaCl溶液，于30 ℃烘干，粉碎，過40目篩，待用。見表1。

表1 各分組樣品編號

編號鹽分濃度(mmol/L)培養(yǎng)時間(d)編號鹽分濃度(mmol/L)培養(yǎng)時間(d)100235422022454430425546406265485082754106010285412701229541580153072291823172410184327261118633728121883472101318103572121418123672151518153790216362389041736439906183664090819368419010203610429012213612439015223615

2.2 初生代謝產(chǎn)物的提取

精密稱定0.05 g樣品于10 mL離心管中，加入80%乙醇4 mL，80 ℃恒溫水浴加熱10 min，取出放置待室溫后5 000 r/min離心10 min，取出上清液于具塞試管中，將殘渣加入2 mL 80%乙醇，重復(fù)2次。合并3次上清液。將合并后上清液過濾至10 mL容量瓶中，用80%乙醇定容待用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 蔗糖線性關(guān)系考察

精密稱定恒重后蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品10.2 mg于10 mL容量瓶中，用80%乙醇定容，作為母液。用移液管分別吸取0.5，1.0，1.5，2，2.5 mL母液于5mL容量瓶中，80%乙醇定容。分別吸取上述溶液1 mL于具塞試管中，加入5 mL蒽酮-硫酸溶液混勻，沸水浴10 min后取出，冷卻，立即在625 nm處測定。以蔗糖含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。說明蔗糖在0.102～0.510 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 可溶性糖濃度與吸光值關(guān)系

序號12345蔗糖濃度(mg/mL)0.1020.2040.3060.4080.51平均值0.24960.39190.66460.83111.0175回歸曲線方程y=1.9362x+0.0384,r=0.9960

2.3.2 丙酮酸線性關(guān)系考察

精密稱定丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品10.5 mg于10 mL容量瓶中，80%乙醇定容，作為母液。別吸取0.5,1.0,1.5,2,2.5 mL母液于5mL容量瓶中，用80%乙醇溶液定容。分別吸取上述溶液1 mL于試管中，依次加入8%三氯乙酸溶液2 mL、0.1% 2,4-二硝基苯肼溶液1 mL、2.0 mol/L NaOH溶液4 mL，搖勻，靜置10 min于320 nm處進(jìn)行測定。以丙酮酸含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：y=0.886 9x+0.14，r=0.997 0(見表3)。說明丙酮酸在0.105～0.525 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表3 丙酮酸濃度與吸光值關(guān)系

序號12345丙酮酸濃度(mg/mL)0.1050.210.3150.420.525平均值0.22350.34420.41580.5040.6092回歸曲線方程y=0.8869x+0.14,r=0.9970

2.3.3 重復(fù)性試驗

取同一供試品5份，分別按樣品溶液制備方法操作測定，計算可溶性糖、丙酮酸含量，得平均值分別為1.3 %、1.1%，RSD分別為1.48%、1.25%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣測定可溶性糖、丙酮酸。計算RSD分別為1.03%、1.42%，表明供試品溶液在12 h穩(wěn)定性良好。

2.3.5 精密度試驗

取同一批樣品5份，按照2.2方法制備供試品溶液，按照2.3.1方法測定可溶性糖，計算RSD為1.35%，按照2.3.2方法測定丙酮酸，計算RSD為1.06%，說明精密度良好。

2.3.6 回收率試驗

精密稱取樣品(5份)和蔗糖對照品儲備液1 mL，按樣品溶液的配制方法制備供試液，用紫外分光光度法，以80%乙醇為空白溶液，在625 nm處進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果蔗糖平均回收率為99.2%，RSD為1.68%；精密稱取龍樣品(5份)和丙酮酸對照品儲備液1 mL，按樣品溶液的配制方法制備供試液，用紫外分光光度法，以80%乙醇為空白溶液，在320 nm處進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果丙酮酸平均回收率為100.3%，RSD為1.28%?；厥章矢?，且相對偏差較小，表明以上分析樣品制備方法的準(zhǔn)確度高，可靠性強(qiáng)。

2.4 可溶性糖的含量測定

采用蒽酮-硫酸比色法[5]對可溶性糖進(jìn)行含量測定。分別精密吸取2.2項下定容后各樣品1 mL于具塞試管中，分別加入5 mL蒽酮-硫酸試劑，沸水浴10 min，取出后立即用流水沖洗至室溫。于625 nm處進(jìn)行檢測，各處理組可溶性糖含量如表4，各處理組可溶性糖含量趨勢圖如圖1。

圖1 各處理組可溶性糖含量折線圖

2.5 丙酮酸含量測定

分別精密吸取2.2項下定容后溶液1 mL于試管中，分別依次加入8%三氯乙酸溶液2 mL、0.1% 2,4-二硝基苯肼溶液1 mL、2.0 mol/L NaOH溶液4 mL，搖勻，靜置10 min于320 nm處進(jìn)行測定，各處理組丙酮酸含量如表4，各處理組丙酮酸變化趨勢如圖2。

1.龍膽苦苷；2.獐牙菜苷。圖3 對照品(A)和龍膽種子樣品(B) HPLC色譜圖

圖2 各處理組丙酮酸含量折線圖

2.6 次生代謝產(chǎn)物的含量測定

2.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(250×4.6 mm,5μm)，流動相用0.1%甲酸-水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫[0～16 min,78%A→75%A,22%B→25%B;16～40 min,75%A→84%A,25%B→16%B;40～60 min,84%A→50%A,16%B→50%B]。流速1.0 mL/min，柱溫:35 ℃。檢測波長：240 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL。色譜圖見圖3。

2.6.2 供試品溶液的制備

精密稱定0.2 g樣品粉末于50 mL錐形瓶中，加入10 mL甲醇，精密稱定，超聲提取(100 W,40 kHz)40 min，冷卻至室溫后補(bǔ)足失重，過濾。續(xù)濾液過0.22μm微孔濾膜待用。

2.6.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取龍膽苦苷、獐牙菜苷

對照品適量，用甲醇分別配制成0.991 mg/mL、0.197 4 mg/mL的龍膽苦苷、獐牙菜苷儲備液。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取適量“2.6.3”項下儲備液，配制成含龍膽苦苷、獐牙菜苷0.003 3、0.002 2 mg/mL；0.004 96、0.003 3 mg/mL；0.009 9、0.004 9 mg/mL；0.012 4、0.006 6 mg/mL；0.0198 2、0.009 9 mg/mL；0.247 75、0.019 7 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按“2.6.1”項下的色譜條件測定，結(jié)果表明，龍膽苦苷、獐牙菜苷質(zhì)量濃度(x)分別在0.003 3～0.247 75 mg/mL、0.002 2～0.019 7 mg/mL時與峰面積(y)呈線性關(guān)系。回歸方程分別為：y=11 613x-12.655，r=1；y=158 56x-8.689 6，r=0.999 1。

2.7.2 精密度實驗

精密吸取同一對照品溶液進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，龍膽苦苷和獐牙菜苷的峰面積RSD分別為1.2%、0.93%(n=6)。

2.7.3 重復(fù)性實驗

精密稱取同一樣品粉末(0 mmol/L，15 d)0.2 g，按“2.6.2”項下供試品制備方法6份樣品溶液，按“2.6.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，測得結(jié)果的龍膽苦苷、獐牙菜苷RSD分別為1.5%、1.3%(n=6)。

2.7.4 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h測定，結(jié)果表明龍膽苦苷、獐牙菜苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，峰面積RSD分別為1.4%、1.1%。

2.7.5 加樣回收率實驗

精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品粉末6份各0.1 g，每份分別準(zhǔn)確加入龍膽苦苷、獐牙菜苷對照品適量，制備樣品溶液，分別進(jìn)樣10μL測定。結(jié)果龍膽苦苷平均回收率99.9%，RSD為1.2%(n=3)；獐牙菜苷平均回收率101.0%，RSD為1.3%(n=3)。

2.8 樣品含量測定

取不同鹽分脅迫條件下各培養(yǎng)時期的龍膽種子粉末樣品0.2 g，按“2.6.2”項下方法制備樣品溶液，測定，結(jié)果見表4，色譜圖見圖3，龍膽苦苷、獐牙菜苷含量折線圖如圖4、圖5。

表4 樣品測定結(jié)果(n=3)

編號可溶性糖(%)丙酮酸(%)龍膽苦苷(%)獐牙菜苷(%)編號可溶性糖(%)丙酮酸(%)龍膽苦苷(%)獐牙菜苷(%)13.514912.8562未檢出0.0267230.98877.9705未檢出痕量23.62595.9978未檢出0.0143241.35098.3321未檢出痕量33.01775.3200痕量0.0169251.28185.8616未檢出0.014043.28183.6404痕量0.0505261.97576.05220.01880.029953.52263.62430.13800.0728271.52323.96310.01960.023762.498710.03860.56020.0801283.65707.08010.02380.027173.42033.61300.62150.0854292.47523.19430.03080.033185.231012.23631.04980.0986301.38759.7734痕量0.013792.28064.4195未檢出0.0203312.36319.6886痕量痕量101.76934.0958痕量0.0160321.58366.5523痕量0.0155113.02474.23710.03750.0301332.47297.39280.02160.0326122.72663.94920.07690.0569342.74975.53200.02090.0280133.98813.69020.13610.0736350.73056.30400.02610.0313143.61433.56620.23000.0840361.42405.74330.02710.0183153.36343.02020.22800.0587370.91628.9119未檢出痕量163.39827.2102未檢出痕量380.71037.3218痕量痕量172.72216.4824未檢出0.0126390.82977.8666痕量痕量182.91585.4447痕量0.0165401.65943.8859痕量0.0147192.32534.93950.05710.0494411.26206.1767痕量0.0154203.45854.86160.06210.0610421.72948.8431痕量0.0311212.73024.69210.07140.0429431.36496.1912痕量0.0192223.31834.37340.12630.0265

注：痕量是指樣品中待測組分含量低于百萬分之一。

圖4 龍膽苦苷含量折線圖

圖5 獐牙菜苷含量折線圖

3 相關(guān)性分析

采用SPSS 20.0軟件中雙變量分析方法，計算43個樣品中龍膽苦苷、獐牙菜苷與可溶性糖、丙酮酸的Spearman相關(guān)性，結(jié)果見表5?？芍扇苄蕴桥c龍膽苦苷和獐牙菜苷均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為r1=0.528，r2=0.598，雙側(cè)P為0.000；丙酮酸與龍膽苦苷獐牙菜苷均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為r3=-0.421，r4=-0.470，雙側(cè)P分別為0.005、0.001。

表5 樣品中龍膽苦苷、獐牙菜苷與可溶性糖、丙酮酸的相關(guān)性分析

化合物 相關(guān)性 顯著性(雙側(cè)) 龍膽苦苷獐牙菜苷龍膽苦苷獐牙菜苷可溶性糖0.528**0.598**0.0000.000丙酮酸-0.421**-0.470**0.0050.001

注：**表示p< 0.01 顯著相關(guān)。

4 分析與討論

4.1 鹽分脅迫對初生代謝產(chǎn)物含量的影響

4.1.1 對可溶性糖含量的影響

根據(jù)結(jié)果可知，對照組可溶性糖含量的變化趨勢前期趨于水平，第8天開始上升，第15天達(dá)到峰值。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因為種子萌發(fā)時消耗可溶性糖，可溶性糖通過光合作用轉(zhuǎn)化而來，而在第8天的時候植物體內(nèi)可溶性糖的積累程度要高于其轉(zhuǎn)化的程度，故第15天的可溶性糖含量略高于初始天數(shù)。經(jīng)SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析得知，對照組及各處理組之間(p<0.01)，具有極顯著性差異，說明不同濃度NaCl溶液對龍膽種子可溶性糖含量的積累與轉(zhuǎn)化具有顯著影響。通過單因素方差分析得知，對照組與各處理組之間具有顯著性差異(p<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義；18 mmol/L與36 mmol/L 2個處理組之間無顯著性差異；72 mmol/L與90 mmol/L 2個處理組之間無顯著性差異。

4.1.2 對龍膽種子萌發(fā)期間丙酮酸含量的影響

丙酮酸是MEP途徑的重要前體物質(zhì)之一[6]，種子萌發(fā)期間其體內(nèi)丙酮酸的含量積累是一個動態(tài)變化的過程，丙酮酸含量于第8天開始增加，在第10天達(dá)到最高值，后又下降，15 d時比初始天數(shù)含量略高。各處理組第15天的丙酮酸含量均低于初始天數(shù)，證明鹽分脅迫抑制了種子的萌發(fā)。經(jīng)SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析得知，對照組及各處理組之間具有極顯著性差異(p<0.05)，說明不同濃度的NaCl溶液對龍膽種子丙酮酸的含量累積具有顯著性影響。通過單因素方差分析得知，對照組與各處理組之間具有顯著性差異(p<0.05)；18 mmol/L與54 mmol/L 2個處理組之間的無顯著性差異；72 mmol/L與90 mmol/L 2個處理組之間無顯著性差異。

4.2 鹽分脅迫對次生代謝產(chǎn)物含量的影響

4.2.1 對龍膽苦苷含量的影響

未萌發(fā)的種子中未檢測到龍膽苦苷成分，而在種子萌發(fā)的第6天，龍膽苦苷含量開始達(dá)到檢測限，而后呈現(xiàn)上升的趨勢。在對照組處理條件下，龍膽苦苷的積累速度最快，可知NaCl溶液濃度越大，龍膽苦苷的積累越慢。經(jīng)SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析得知，對照組及各處理組之間存在顯著性差異(p<0.05)，說明不同濃度的NaCl溶液對龍膽種子的含量累積具有顯著性影響。通過單因素方差得知，對照組與各處理組之間具有顯著性差異(p<0.05)，18 mmol/L與其他處理組之間具有顯著性差異(p<0.05)。54 mmol/L與72 mmol/L 2個處理組之間、54 mmol/L與90 mmol/L 2個處理組之間、72 mmol/L與90 mmol/L 2個處理組之間均無顯著性差異。龍膽中主要有效成分為龍膽苦苷，結(jié)果證明，在種子萌發(fā)的過程中，若NaCl濃度達(dá)到54 mmol/L以上，不利于龍膽苦苷的積累，故在進(jìn)行龍膽栽培種植時，土壤中鹽分濃度不宜高于54 mmol/L。

4.2.2 對龍膽種子萌發(fā)期間獐牙菜苷含量的影響

龍膽種子中含有獐牙菜苷，通過實驗結(jié)果可知，種子萌發(fā)過程中獐牙菜苷的含量整體呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢。對數(shù)據(jù)分析得知，對照組及各處理組之間具有顯著性差異(p<0.05)，可認(rèn)為不同濃度的NaCl溶液對種子中獐牙菜苷的積累有顯著影響。72 mmol/L與90 mmol/L 2個處理組之間無顯著性差異(p>0.05)。

5 結(jié) 論

結(jié)果表明，隨著丙酮酸的減少，龍膽苦苷、獐牙菜苷的含量是不斷積累的，可以認(rèn)為鹽分脅迫主要通過影響丙酮酸的含量來調(diào)控龍膽苦苷和獐牙菜苷的合成。龍膽種子輕度耐鹽，當(dāng)鹽分濃度超過54 mmol/L時，龍膽中丙酮酸的合成受到顯著影響，進(jìn)而影響有效成分的含量累積。在進(jìn)行龍膽種子播種時，應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測土壤的鹽漬化程度，以實現(xiàn)龍膽藥材的高質(zhì)量、高產(chǎn)量生產(chǎn)。