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(1.四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000；2.云南省藥物研究所，昆明 650111)

七葉蓮(Scheffleravenulosa)為五加科(Araliaceae)鵝掌柴屬(Schefflera)植物密脈鵝掌柴。七葉蓮具有止痛散瘀，活血消腫，舒經(jīng)活絡(luò)的功效，收載于2005版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[1]，為痛舒膠囊、腫痛氣霧劑、七葉蓮片及復(fù)方風(fēng)濕寧片等中成藥的主要原料。近年來，隨著七葉蓮藥效的不斷發(fā)掘，七葉蓮需求量逐年增加，而目前七葉蓮藥材基本來源于野生資源，為保障市場(chǎng)需求及保護(hù)野生資源，迫切需要開展七葉蓮栽培研究。種子檢驗(yàn)可評(píng)價(jià)和控制種子質(zhì)量，是保證種子質(zhì)量的關(guān)鍵措施[2-3]，為保障七葉蓮種子質(zhì)量，亟需研究其種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法。本研究以七葉蓮種子為試驗(yàn)材料，依據(jù)我國(guó)農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程的方法[4]，開展七葉蓮種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究，以期為七葉蓮種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù)和支持。

1 材 料

2016年6月，七葉蓮種子采自普洱市思茅區(qū)六順鎮(zhèn)、普洱市孟連縣富巖鄉(xiāng)、普洱市思茅區(qū)倚象鎮(zhèn)、普洱市寧洱縣寧洱鎮(zhèn)、玉溪市元江縣因遠(yuǎn)鎮(zhèn)5個(gè)居群。經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所研究員李恒鑒定為五加科鵝掌柴屬植物七葉蓮(Scheffleravenulosa)。

2 方 法

2.1 扦 樣

七葉蓮種子扦樣依據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》規(guī)定進(jìn)行[3-4]。

2.2 凈度分析

七葉蓮種子凈度分析依據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》規(guī)定進(jìn)行[3-4]。

2.3 種子真實(shí)性鑒定

體視顯微鏡下觀察種子形態(tài)特征，并用數(shù)顯卡尺測(cè)量其長(zhǎng)寬度[3]。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次100粒種子。

2.4 種子水分測(cè)定

七葉蓮種子水分測(cè)定采用低恒溫(105 ℃)烘干法和高溫(130 ℃)烘干法進(jìn)行，準(zhǔn)確稱取每份種子樣品2 g，要求每份樣品2次測(cè)定值差距不超過0.2%，試驗(yàn)2次重復(fù)[3-5]。

2.5 種子重量測(cè)定

采用百粒法和千粒法進(jìn)行[3-5]。

2.6 種子生活力測(cè)定

2.6.1 染色溫度和時(shí)間

將七葉蓮種子于蒸餾水中浸泡24 h，縱切，留一半備用。用0.05%TTC溶液浸沒縱切后的種子，分別置于20，25 ℃和30 ℃ 的恒溫光照培養(yǎng)箱中，避光條件下染色4，8，16，24 h和48 h后進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)染色情況，試驗(yàn)3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子[4,6]。

2.6.2 TTC濃度確定

將七葉蓮縱切后的種子完全浸沒于0.01%，0.05%和0.1%TTC溶液中避光染色，觀察并統(tǒng)計(jì)染色情況，試驗(yàn)3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子[4,6]。

2.7 種子發(fā)芽率測(cè)定

2.7.1 發(fā)芽溫度確定

將種子置于2層濾紙培養(yǎng)皿中，分別于15，20 ℃和25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，試驗(yàn)3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子[4,7]。

2.7.2 光照時(shí)間確定

將種子置于鋪有2層濾紙培養(yǎng)皿中，在25 ℃下光照0 h和25 ℃下光照12 h的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子[4,7]。

2.7.3 發(fā)芽床選擇

選取紙上、砂上、砂中3種發(fā)芽床。將種子分別置于不同發(fā)芽床上，在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子[4,7]。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦 樣

七葉蓮種子扦樣采用分樣器進(jìn)行，種子批的最大總重量為5 000 g，種子送檢樣品不少于500 g，種子凈度分析試樣不少于50 g。

3.2 種子真實(shí)性鑒定

七葉蓮種子形狀為腎形，灰白色，表面粗糙。種子長(zhǎng)度為3.2～5.0 mm，寬度為1.6～2.8 mm。

3.3 種子凈度分析

七葉蓮種子凈度分析結(jié)果見表1。七葉蓮種子雜質(zhì)主要為果梗和果皮，無其它植物種子。5個(gè)產(chǎn)地七葉蓮種子凈度均在82.0%以上，各產(chǎn)地試樣增失差距均沒有偏離分取樣品質(zhì)量的5.0%，因此該方法和程序適宜用于七葉蓮種子凈度分析。

表1 不同產(chǎn)地七葉蓮種子凈度分析

樣本號(hào)采集地點(diǎn)分取樣品質(zhì)量(g)凈種子質(zhì)量(g)雜質(zhì)質(zhì)量(g)增失(%)凈度(%)1普洱市思茅區(qū)六順鎮(zhèn)50.1348.211.850.1496.172普洱孟連縣富巖鄉(xiāng)49.9247.902.000.0495.953普洱市思茅區(qū)倚象鎮(zhèn)50.0847.013.030.0893.874普洱市寧洱縣寧洱鎮(zhèn)50.1541.158.970.0682.055玉溪市元江縣因遠(yuǎn)鎮(zhèn)50.2147.252.860.2094.10

3.4 種子水分測(cè)定

采用低恒溫(105 ℃)和高恒溫(130 ℃)烘干法測(cè)定5個(gè)產(chǎn)地七葉蓮種子水分結(jié)果如圖1和圖2所示。采用低恒溫烘干法，七葉蓮種子在60 min內(nèi)失水迅速，之后種子失水變緩，種子水分在70 min后保持穩(wěn)定，因此，低恒溫烘干法測(cè)定七葉蓮種子水分適宜烘干時(shí)間為70 min。采用高恒溫烘干法，七葉蓮種子在25 min內(nèi)失水迅速，之后種子失水減緩，種子水分在30 min后保持穩(wěn)定，因此，高恒溫烘干法測(cè)定七葉蓮種子水分適宜烘干時(shí)間為30 min。比較高恒溫烘干法和低恒溫烘干法測(cè)定的種子水分結(jié)果可知，高恒溫烘干法測(cè)定的種子水分高于低恒溫烘干法，且烘干時(shí)間短。因此，七葉蓮種子水分測(cè)定適宜方法為高恒溫烘干法，烘干時(shí)間為30 min。

圖1 低恒溫(105 ℃)烘干法測(cè)定種子水分

圖2 高恒溫(130 ℃)烘干法測(cè)定種子水分

采用高恒溫烘干法(130 ℃)對(duì)5個(gè)產(chǎn)地七葉蓮種子水分測(cè)定可知(圖2)，七葉蓮種子水分為10.3% ～10.8%。

3.5 種子重量測(cè)定

采用百粒法和千粒法分別測(cè)定5個(gè)產(chǎn)地七葉蓮種子千粒重，測(cè)定結(jié)果見表 2。采用百粒法測(cè)定七葉蓮種子千粒重時(shí)，樣本2和樣本4變異系數(shù)均大于4.0%，表明測(cè)定值無效，故七葉蓮種子千粒重測(cè)定不宜采用百粒法進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)用千粒法測(cè)定時(shí)，2次測(cè)得的差數(shù)和平均數(shù)之比均小于5.0%，表明測(cè)定值有效。因此，七葉蓮種子重量測(cè)定適宜的方法為千粒法，千粒重為1.2～1.8 g(表2)。

3.6 種子生活力測(cè)定

3.6.1 染色溫度和時(shí)間

七葉蓮種子生活力測(cè)定受TTC染色溫度和時(shí)間的影響(表3)。有生活力的七葉蓮種胚被 TTC 染為鮮紅色，染色均勻，胚乳完全著鮮紅色或淺紅色。采用0.05%TTC在20，25 ℃和30 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中，避光條件下染色16，24，48，52 h后結(jié)果如表3所示。隨著溫度升高，測(cè)定的七葉蓮種子生活力值增加，但均在染色48 h后趨于穩(wěn)定，表明染色適宜時(shí)間為48 h。同時(shí)25 ℃和30 ℃下染色48 h的七葉蓮種子生活力差異不顯著，表明染色適宜溫度為25 ℃，在此條件下測(cè)定的七葉蓮種子生活力為82.7%。

表2 不同產(chǎn)地七葉蓮種子重量測(cè)定

樣本號(hào) 百粒法 千粒法 千粒重(g)標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)(%)千粒重(g)重復(fù)間差數(shù)(g)差數(shù)/平均數(shù)11.22810.00181.501.23220.00730.5921.60070.00684.221.61290.01580.9831.27360.00221.701.26600.00920.7341.19560.00282.361.16260.01631.4051.80050.01194.251.76250.03761.36

表3 染色溫度和時(shí)間與種子生活力測(cè)定的關(guān)系

染色溫度(℃)染色時(shí)間(h)162448522020.7c43.0c62.3b63.0b2532.3b56.3b82.7a83.3a3047.7a66.7a85.0a86.3a

注：表格中不同字母表示差異顯著[8]。本試驗(yàn)所用種子為5個(gè)產(chǎn)地種子混合樣品。

3.6.2 TTC濃度確定

七葉蓮種子生活力測(cè)定值隨著TTC濃度的增加先升高后降低，但均在TTC濃度為0.05%時(shí)達(dá)到最大值(表4)，分別為83.9%、81.0%、94.1%、90.0%和86.7%，表明七葉蓮種子生活力測(cè)定宜采用濃度為0.05%TTC進(jìn)行。

表4 TTC濃度與七葉蓮種子生活力測(cè)定的關(guān)系

TTC濃度(%)樣本號(hào)123450.0173.3b72.7b86.0b80.7b74.3b0.0583.9a81.0a94.1a90.0a86.7a0.174.7b75.3b92.3a88.7a86.0a

3.7 種子發(fā)芽率測(cè)定

3.7.1 發(fā)芽溫度確定

七葉蓮種子發(fā)芽率隨著溫度的升高而增加(表5)。5個(gè)產(chǎn)地七葉蓮種子發(fā)芽率均在25 ℃時(shí)最高，表明25 ℃為七葉蓮種子發(fā)芽的適宜溫度。25 ℃下七葉蓮種子發(fā)芽率分別為68.7%、67.3%、85.0%、76.7%和74.3%，顯著高于20 ℃和15 ℃下七葉蓮種子發(fā)芽率(p<0.05)。

3.7.2 光照時(shí)間確定

光照時(shí)間對(duì)七葉蓮種子發(fā)芽的影響如表6所示，5個(gè)產(chǎn)地七葉蓮種子在光照0 h和光照12 h下發(fā)芽率均無顯著差異(p>0.05)。因此，光照時(shí)間對(duì)七葉蓮種子發(fā)芽無顯著影響。

表5 溫度與七葉蓮種子發(fā)芽的關(guān)系

發(fā)芽溫度(℃)樣本號(hào)123451547.0c44.7c61.3c50.7c51.3c2058.3b60.7b74.0b69.7b63.0b2568.7a67.3a85.0a76.7a74.3a

表6 光照時(shí)間與七葉蓮種子發(fā)芽的關(guān)系

光照時(shí)間(h)樣本號(hào)12345069.3a65.0a82.3a80.0a72.7a1268.7a67.3a85.0a76.7a74.3a

3.7.3 發(fā)芽床確定

發(fā)芽床對(duì)七葉蓮種子發(fā)芽的影響如表7所示，5個(gè)產(chǎn)地七葉蓮種子分別在紙上、砂上和砂中3種發(fā)芽床下發(fā)芽率無顯著差異。鑒于發(fā)芽床對(duì)七葉蓮種子發(fā)芽無顯著影響，而從操作方便性上考慮，適宜選擇紙上發(fā)芽床進(jìn)行測(cè)定。

表7 發(fā)芽床與七葉蓮種子發(fā)芽的關(guān)系

發(fā)芽床樣本號(hào)12345紙上68.7a67.3a85.0a76.7a74.3a砂上65.3a69.0a84.3a79.0a70.7a砂中67.0a65.0a87.7a74.7a75.0a

4 結(jié)論與討論

目前，我國(guó)僅有少量中藥材種子有相應(yīng)的種子檢驗(yàn)方法，如川牛膝、三七、甘草、丹參、白花蛇舌草等，絕大部分中藥材種子仍缺乏種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法，無法評(píng)價(jià)和控制其種子質(zhì)量[9-13]。隨著對(duì)七葉蓮開發(fā)應(yīng)用的不斷研究，其市場(chǎng)需求量顯著增加，當(dāng)前已逐漸開始人工栽培種植，但當(dāng)前七葉蓮種子尚未有相應(yīng)的種子質(zhì)量檢驗(yàn)的方法，以致生產(chǎn)的七葉蓮種子質(zhì)量參差不齊，顯著影響其藥材質(zhì)量。

本研究通過測(cè)定不同產(chǎn)地七葉蓮種子質(zhì)量，明確了七葉蓮種子質(zhì)量檢驗(yàn)適宜的方法。具體方法為：種子凈度分析試樣應(yīng)不少于50 g；種子真實(shí)性鑒定宜采用體視顯微鏡觀察；水分測(cè)定宜采用高恒溫(130 ℃)烘干法，烘30 min；重量測(cè)定宜采用千粒法；生活力測(cè)定宜采用0.05%TTC，25 ℃下避光染色48 h；發(fā)芽率測(cè)定宜采用紙上發(fā)芽床，發(fā)芽溫度為25 ℃。不同產(chǎn)地氣候自然環(huán)境存在一定區(qū)別，對(duì)種子發(fā)育及生物學(xué)特性均會(huì)產(chǎn)生影響，因此，對(duì)中藥材種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究時(shí)應(yīng)重視試驗(yàn)材料的可代表性[14-15]。研究所用七葉蓮種子采于5個(gè)七葉蓮主產(chǎn)區(qū)，具有較好的代表性，可有效避免產(chǎn)地不同導(dǎo)致的生物學(xué)特性差異對(duì)七葉蓮種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法造成的影響。本研究通過對(duì)5個(gè)產(chǎn)地七葉蓮種子質(zhì)量的測(cè)定，明確了七葉蓮種子質(zhì)量檢驗(yàn)的方法，可為建立七葉蓮種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)和支持。