桑圣剛，王夢旖，肖 曼，杜冠魁

(海南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，?？?571100)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一個重大的公共健康問題[1]. HBV是一種部分雙鏈的環(huán)狀DNA病毒，其負(fù)鏈DNA含有4個開放性閱讀框，分別稱為為S、C、X及P區(qū)，分別編碼表面抗原(HBsAg)、核心和分泌型抗原(HBcAg和HBeAg)、X蛋白(HBx)、多聚酶(HBV P)，這些蛋白在HBV的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和DNA循環(huán)等環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要的作用. 近幾年針對這幾個編碼框做了很多RNA的干擾研究工作. 其中，X區(qū)是最小的片段，約465 bp，所編碼的HBx蛋白具有反式激活功能，可以反式激活多種細(xì)胞及病毒啟動子和多種細(xì)胞原癌基因啟動子，因此在病毒復(fù)制和肝癌的形成中起著重要作用. HBV-X蛋白(HBx)是一個多功能調(diào)節(jié)蛋白，對基因轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等均具調(diào)節(jié)作用，HBx可能通過這些作用直接或間接調(diào)控HBV復(fù)制，并可能導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變. 用小干擾RNA進(jìn)行基因治療可能是抑制病毒表達(dá)和疾病進(jìn)展的有效方法，而乙型肝炎病毒X基因(HBx)可能是此治療的最佳靶點(diǎn)[2].本研究以siRNA干擾技術(shù)構(gòu)建HBx-siRNA的病毒表達(dá)，擬構(gòu)建針對HBx基因短發(fā)夾小干擾RNA(Short hairpin RNA, shRNA)的表達(dá)質(zhì)粒，為研究抗HBV的生物治療提供有力的工具和新的靶點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞系

載體pGenesil-3.1[攜帶紅色熒光蛋白(Ds-Red2)]、大腸桿菌株Trans5α和HepG2.2.15細(xì)胞系均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 主要試劑

Annealing Buffer for DNA Oligos (5×)、限制性內(nèi)切酶Hind III、BamH I、Sal I，RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0、Trizol、Agarose D-5(TaKaRa)；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(生工生物工程公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根公司)；DMEM/HIGH GLUCOSE、Phosphate Buffered Saline (1×)(HyClone公司)；Trypsin EDTA Solution A、Fetal Bovine Serum(BI公司，以色列)；Trizma base、Tryptone、Yeast Extract(OXOID公司，英國)；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(DOJINDO公司，日本)、TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金)、Accuri C6 flow cytometer (BD公司，美國)；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.3 載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank中登錄的HBxmRNA基因序列(2182117)，同時參照Sergio Carmona的方法[3]U6 shRNA 5.2，

設(shè)計(jì)序列：

HBV1-A 5′-GATCCGGCACACGTGAAGCGAAGTGGAGTTCAAGACGCTCCACTTCGCTTCACGTGTGCCTTTTTGTCGACA-3′，

HBV1-B：5′-AGCTTGTCGACAAAAAAGGCACACGTGAAGCGAAGTGGAGCGTCTTGAACTCCACTTCGCTTCACGTGTGCCG-3′.

轉(zhuǎn)錄模板合成的引物結(jié)構(gòu)：BamH I +Sense+Loop+Antisense+終止信號+SalI +Hind III. 用DEPC水溶解兩條shRNA引物，至終濃度為100 μmol/L的儲存液，各取10 μL與10 μL DEPC水混勻至50 μmol/L. 95 ℃退火反應(yīng)體系，取退火產(chǎn)物1 μL與99 mL ddH2O混勻做100倍稀釋. 退火處理后的shRNA模板應(yīng)用于連接反應(yīng). 稀釋過的退火片段與經(jīng)過Hind III和BamH I酶切的pGenesil-3.1質(zhì)粒載體連接，取25 μL過夜的連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Trans5α，涂布于含有35 ng/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h；挑取單克隆菌落接種于10 mL含35 ng/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 250 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)14 h，提取質(zhì)粒，于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HepG2.2.15細(xì)胞復(fù)蘇，加入2.5 mL完全培養(yǎng)基，充分吹散細(xì)胞，吸至25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃恒溫、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，然后換液. 2～3 d后消化，加入200 μL無血清無雙抗培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，選擇適當(dāng)比例與質(zhì)?；靹?質(zhì)粒需10 μg)，將混合液加入電轉(zhuǎn)杯，并于4 ℃冰箱放置10 min后將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀，參數(shù)設(shè)置選擇為真核模式2個電脈沖、 脈沖時間200 μs、 電壓270 V. 電轉(zhuǎn)完成后立即加入15%FBS無雙抗培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后換新鮮的15%FBS無雙抗培養(yǎng)基. 24 h后換含有10%FBS與適量濃度G418的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng). 轉(zhuǎn)染48 h后用熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)情況，并計(jì)算轉(zhuǎn)染率.

1.5 HBx基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測

采用QRT-PCR法. 轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，擴(kuò)增HBx基因. 根據(jù)文獻(xiàn)[4]得GAPDH與HBx定量引物序列(表1). 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共45個循環(huán).

表1 定量引物序列Tab.1 Quantitative primer sequences

1.6 CCK-8細(xì)胞增殖檢測

采用CCK-8細(xì)胞增殖檢測法. 將未轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的HepG2.2.15細(xì)胞與已轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的HepG2.2.15細(xì)胞分別消化，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使得每孔細(xì)胞數(shù)在4000個/100 μL左右，每個樣5個復(fù)孔. 將96孔板在37 ℃恒溫、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μL CCK-8，于37 ℃恒溫箱反應(yīng)30 min后放入酶標(biāo)儀在OD450處測定吸光值，測完后放回恒溫箱繼續(xù)反應(yīng)，之后每30min測定一次吸光值，共測8次.

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測. 將未轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的HepG2.2.15細(xì)胞與已轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的HepG2.2.15細(xì)胞分別消化，操作步驟參考細(xì)胞凋亡分析試劑盒說明書. 用500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，一個細(xì)胞樣品加入5 μLAnnexin V-PE 再加入5 μL7-AAD. 旋渦輕微震蕩數(shù)秒. 孵育30 min. 加入400 μL染色緩沖液，通過AccuriC6 flow cytometer對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測與分析.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 線性化pGenesil-3.1質(zhì)粒載體獲得

根據(jù)pGenesil-3.1質(zhì)粒載體序列，找到在其U6啟動子下存在的Hind III和BamH I酶切位點(diǎn).并且這兩個酶切位點(diǎn)有且只有一個，所以利用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I進(jìn)行酶切獲取線性化pGenesil-3.1質(zhì)粒(圖1). 由于這兩種內(nèi)切酶所用的反應(yīng)液不同，所以先用Hind III進(jìn)行單酶切,回收后再用BamH I進(jìn)行單酶切,第二次回收產(chǎn)物即為線性化pGenesil-3.1質(zhì)粒，見圖2～5.

圖1 pGenesil-3.1質(zhì)粒載體圖譜Fig.1 Map of pGenesil-3.1 plasmid vector

M:DL15000;1：未酶切質(zhì)粒；2，3：經(jīng)Hind III單酶切的質(zhì)粒圖2 pGenesil-3.1質(zhì)粒Hind III單酶切Fig.2 The single digestion of pGenesil-3.1 plasmid Hind III

M1：DL15000；M2： DL15000；1: 回收產(chǎn)物；M3: DL15000圖3 質(zhì)粒經(jīng)Hind III單酶切后回收鑒定Fig.3 Recovered by single Hind III digestion

M1：DL2000；1：未酶切質(zhì)粒；2，3：經(jīng)BamH I單酶切的質(zhì)粒；M2：DL15000圖4 第一次回收產(chǎn)物再經(jīng)BamH I單酶切Fig.4 Digested with BamH I after first recovered

M1： DL15000；M2：DL15000；1:回收產(chǎn)物；M3:DL15000 圖5 第一次回收產(chǎn)物經(jīng)BamH I單酶切后回收鑒定Fig.5 Identification of the first recovered product after BamH I single digestion.

2.2 重組質(zhì)粒pGenesil-3.1-HBx-shRNA的表達(dá)鑒定

由pGenesil-3.1質(zhì)粒圖譜及序列分析可知，有且只有在1959 bp處含有SalI酶切位點(diǎn)，故在插入的shRNA中,設(shè)計(jì)了一個SalI酶切位點(diǎn)，經(jīng)SalI酶切重組載體能生成兩個條帶，其中一條約500 bp，說明重組表達(dá)載體pGenesil-3.1-HBx- shRNA構(gòu)建成功，見圖6.

M1：DL2000；1：對照組；2-6：Sal I酶切；M2：DL15000圖6 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.6 Identification of the digested recombinant plasmid vector

2.3 電穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染72 h后，可在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)看見紅色熒光，紅色熒光蛋白在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，空白對照組內(nèi)未見熒光(圖7). 利用有限稀釋法篩選陽性單克隆細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)載體的HepG2.2.15細(xì)胞已能達(dá)到60%以上. 并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，見圖8.

A)普通光；B)熒光 圖7 轉(zhuǎn)染72h的HepG2.2.15細(xì)胞熒光顯微鏡觀察(10×)Fig.7 Screening of HepG2.2.15 cells after 72h transfection in fluorescence microscopy (10×)

A)普通光；B)熒光 圖8 篩選轉(zhuǎn)染后的HepG2.2.15單克隆細(xì)胞熒光顯微鏡觀察(20×)Fig.8 Screening of transfected HepG2.2.15 monoclonal cells in fluorescence microscopy (20×)

2.4 HBx基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

QPT-PCR檢測結(jié)果表明，單克隆培養(yǎng)過后，轉(zhuǎn)染組HBx基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平低于空白對照組. 轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞與空白組相比下降了28%(P<0.05)(圖9).

圖9 QRT-PCR檢測細(xì)胞中HBx基因mRNA的相對表達(dá)量Fig.9 Detection of relative expression of HBx mRNA in cells by QRT-PCR

2.5 CCK-8細(xì)胞增殖檢測

CCK-8細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比. 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖水平下降了47%(P<0.05)，見圖10.

圖10 CCK-8細(xì)胞增殖檢測Fig.10 CCK-8 cell proliferation assay

2.6 細(xì)胞凋亡檢測

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒sh HBx組細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組細(xì)胞晚期凋率增加，細(xì)胞的凋亡率也明顯增加，見圖11.

HepG2.2.15 HepG2.2.15-shRNA圖11 細(xì)胞凋亡檢測Fig.11 Detection of cells apoptosis

3 討論

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染通常導(dǎo)致肝硬化，肝功能衰竭和肝癌[5]. 全球約計(jì)有2.57億人患有慢性病乙型肝炎(CHB)，每年有超過88萬人死于乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)的并發(fā)癥如肝硬化和肝癌(HCC)(WHO報告，2017年7月)[2]. 目前，抗HBV感染的治療，主要包括α-干擾素、核苷(拉米夫定)和核苷酸(阿德福韋)類似物，但這些藥物僅在少數(shù)慢性攜帶者中產(chǎn)生長期反應(yīng)[6]，因此，需要利用各種新技術(shù)新方法繼續(xù)尋找有效的治療方法，比如代謝組學(xué)[7]、基因組學(xué)等.

HBV具有緊湊的基因組，使其非常適合開發(fā)基于核酸雜交的抗病毒療法. 重疊的開放閱讀框(ORF)覆蓋整個病毒基因組[8]，保守區(qū)域可編碼一種以上的蛋白質(zhì)以及病毒復(fù)制所需的HBV順式元件[3].HBx是多功能HBV序列的一個展示.HBx與聚合酶ORF的3′末端重疊，在病毒逆轉(zhuǎn)錄期間可以直接復(fù)制，調(diào)控轉(zhuǎn)錄重要的區(qū)域(基本核心啟動子和負(fù)調(diào)控元件)，是研究核酸雜交療法的良好靶標(biāo).

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由20～30個核苷酸互補(bǔ)單鏈小RNA分子引起的內(nèi)源序列特異性基因沉默機(jī)制[9, 10]，具有多種可編程作用，參與幾種生物過程的調(diào)節(jié)，從而為經(jīng)典治療提供了替代選擇的視角[11]. 短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是一條有互補(bǔ)發(fā)卡環(huán)的RNA序列，經(jīng)常被用在RNA干擾沉默靶基因的表達(dá)中. 構(gòu)建的shRNA表達(dá)載體可以與 U6 啟動子結(jié)合，以啟動shRNA的表達(dá)，并整合進(jìn)入細(xì)胞基因組而被子代細(xì)胞所遺傳，使基因沉默能夠穩(wěn)定實(shí)現(xiàn). 細(xì)胞自身dicer酶可以切割shRNA，將其變成siRNA，隨后siRNA結(jié)合至RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，使之能夠與目的mRNA進(jìn)行識別和配對結(jié)合，并將其降解從而達(dá)到基因沉默的目的.

已有文獻(xiàn)證實(shí)HepG2.2.15細(xì)胞中有HBx蛋白的表達(dá)[12]，本實(shí)驗(yàn)以HepG2.2.15細(xì)胞為研究對象，參照Patrick Arbuthnot[3]發(fā)表的研究成果，利用RNA干擾技術(shù)針對HBx的shRNA序列構(gòu)建pGenesil-3.1-HBx- shRNA重組表達(dá)載體. Sergio Carmona等[3]分析了10個有抗病毒功效的PolⅢ U6啟動子調(diào)控表達(dá)的短發(fā)夾RNA(shRNA)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞中以及在可進(jìn)行HBV復(fù)制的鼠流體動力學(xué)注射模型中shRNA5和shRNA6可敲低80%～100%的HBV標(biāo)記物. 因此，根據(jù)HBV基因U6 shRNA5.2設(shè)計(jì)了一條可編碼HBx反義RNA的shRNA序列，為方便測量抗HBxshRNA的表達(dá)效率，插入編碼紅色熒光蛋白的基因. 通過Dicer處理較大的dsRNA可形成短干擾RNA(siRNA)雙鏈體[13]，其中一條鏈可并入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，靶向作用于互補(bǔ)的細(xì)胞RNA并將其降解[14]. 因此選擇僅有單一酶切位點(diǎn)的Hind III和BamH I酶的質(zhì)粒進(jìn)行切割得到線性化pGenesil-3.1質(zhì)粒，再與專門設(shè)計(jì)的HBx特異的shRNA連接，構(gòu)成了完整的pGenesil-3.1-HBx- shRNA重組表達(dá)載體. 將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)到HepG2.2.15細(xì)胞中，熒光顯微鏡觀察經(jīng)克隆化達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染具有紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到60%以上，QPT-PCR檢測轉(zhuǎn)染組HBx基因水平已明顯降低，這表明pGenesil-3.1-HBx- shRNA重組表達(dá)載體構(gòu)建成功.

對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行增值活力檢測，發(fā)現(xiàn)較空白組細(xì)胞增殖率降低；同時細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率增加. 有文獻(xiàn)報道，HBx基因轉(zhuǎn)染可顯著抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)展至S期，并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)入S期[15]. 且HBx可通過激活EGFR / Akt途徑減少細(xì)胞凋亡[16].HBx的沉默可特異性地降低Dll4和裂解的Notch1的水平，同時明顯降低了Akt和Erk1 / 2的磷酸化水平，使得細(xì)胞凋亡增加和細(xì)胞周期停滯[17]. 最近的一份報告顯示，只有完整的HBx蛋白，而不是具有截短的C末端的蛋白，才能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這進(jìn)一步表明COOH末端區(qū)域是其促凋亡功能所必需的[18]. 以上研究表明，HBx可以抑制凋亡，而本研究構(gòu)建HBx沉默質(zhì)粒后，細(xì)胞的凋亡率增加，這進(jìn)一步證實(shí)pGenesil-3.1-HBx- shRNA重組表達(dá)載體構(gòu)建成功. 但是HBx沉默后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加的具體作用機(jī)制尚不明確，根據(jù)以上的研究結(jié)果，今后將對具體通路變化進(jìn)一步探究.

乙型肝炎病毒HBx基因的shRNA重組表達(dá)載體pGenesil-3.1-HBx- shRNA構(gòu)建成功，并且明顯降低了HepG2.2.15細(xì)胞的活性，這為進(jìn)一步探究HBx對HBV的影響奠定了基礎(chǔ).