沈金花，周 婉

(中南民族大學 生命科學學院，醫(yī)學生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

MTMR14是近年來發(fā)現(xiàn)的一種磷酸肌醇磷酸酶，其特異性底物不是蛋白質(zhì)而是磷酸肌醇. MTMR14在中央核肌病(CNM)、鈣離子調(diào)節(jié)、自噬調(diào)節(jié)中具有重要作用[7]，本文擬通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因敲除細胞系，研究MTMR14基因?qū)Ψ伟┘毎鲋车挠绊?

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

人胚腎細胞株(293T)購自武漢大學細胞庫;肺癌細胞(A549)購自Procell 公司;PX458質(zhì)粒、Stbl3感受態(tài)、10X T4 Ligation Buffer、T4連接酶(武漢淼靈生物);Fast AP、Fast Digest BpiI、10X Fast Digest Buffer、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific);T4 PNK、dNTP、rTaq、10X PCR Buffer(TaKaRa);DTT(Biosharp);去內(nèi)毒素小提試劑盒(Omega Bio-Tek);膠回收試劑盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AxyGen);RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；胰酶、雙抗、Lipo-2000(Invitrogen);血清(ScienceII)BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(碧云天);anti-MTMR14(Abcam);HRP-goat anti mouse IgG、HRP-goat anti rabbit IgG(EarthOx); 引物合成和測序由武漢擎科生物有限公司完成.

超微量分光光度計(Nanodrop 2000,Thermo Fisher Scientific)；酶標儀(Infinite200型，TECAN)；Real-Time PCR System(7500fast型，Applied Biosystems).

1.2 構(gòu)建基因敲減的293T細胞

1.2.1 sgRNA序列的設(shè)計和載體的選擇

利用CRISPR在線設(shè)計工具網(wǎng)站http:∥crispr.mit.edu/，在MTMR14的外顯子設(shè)計sgRNA，根據(jù)評分從高到低選擇4對sgRNA序列(見表1).實驗使用PX458載體，其序列分析見圖1.

表1 MTMR14 sg-RNA引物序列Tab.1 Primer sequences of MTMR14 sg-RNA

注：標有下劃線的部分代表加入的酶切位點序列

圖1 PX458質(zhì)粒結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structure analysis of PX458 plasmid

1.2.2 PX458-sgRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定

用Fast Digest BpiI酶切質(zhì)粒PX458，將sgRNA寡核苷酸鏈退火為雙鏈，與切開的PX458連接，轉(zhuǎn)化至stbl3感受態(tài)中，30 ℃過夜培養(yǎng)，挑取菌落做菌落PCR[8]，送測序驗證載體是否構(gòu)建成功.

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及流式細胞儀分選

給定一個正確率矩陣A=(aij)N×l，aij為第j列分類器對驗證集中第i類樣本的分類正確率.如果mij=1，aij=0，意味著分類器hj對Ci類樣本的分類正確率為0，即分類完全錯誤。此時，應(yīng)將碼字mij變?yōu)?1，其余碼字維持不變.算法1給出了基于正確率變異的具體步驟.

取出前1 d已鋪好的6孔板于顯微鏡下觀察細胞密度，達到70%～80%的匯合度時，按照Lipo-2000的說明書將PX458-sgRNA表達載體轉(zhuǎn)染至293T細胞中.繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用流式細胞儀分選，將成功轉(zhuǎn)入載體的細胞單個分選到96孔板中，待細胞密度長到70%～80%后擴大規(guī)模培養(yǎng).

1.2.4 基因敲除細胞系的鑒定

對每一株細胞進行測序鑒定，看基因是否被編輯.將基因組被編輯的細胞系提蛋白，用Western Blotting檢測MTMR4蛋白的表達.

1.3 構(gòu)建基因敲減的A549細胞

選取A549細胞作為研究的肺癌細胞株.將293T細胞中有作用的PX458-sgRNA表達載體轉(zhuǎn)染至A549細胞中，用流式細胞儀進行分選，并對每一株細胞進行測序鑒定及Western Blotting檢測MTMR4蛋白的表達.

1.4 MTT分析

分別接種1000個生長狀態(tài)較好的A549細胞于96孔板中，每組重復6個，連續(xù)檢測5 d.培養(yǎng)終止前4 h加入20 μL 5 mg/mL的MTT于孔中，無需換液.4 h后完全吸去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，酶標儀振蕩10 min，490 nm檢測其OD值.

1.5 流式細胞儀分析

用15 mL離心管收集一個中皿的細胞，先用預(yù)冷的PBS洗1次，再用冷的PBS重懸細胞，加入3 mL冷的無水乙醇后將細胞吹成單細胞，4 ℃過夜固定細胞.染色前補加5 mL預(yù)冷的PBS至固定的細胞中，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入新鮮配制的PI染色液，37 ℃避光反應(yīng)30 min后用流式細胞儀檢測其細胞周期.

1.6 RT-PCR

分別提取野生型細胞和MTMR14基因敲減的A549細胞的RNA，按照說明上的步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在 Real-Time PCR儀上進行RT-PCR反應(yīng)[9].

1.7 Western Blotting

分別提取野生型細胞和MTMR14基因敲減的A549細胞的蛋白，準備好SDS-PAGE膠后，80 V 40 min，分離膠100 V 1.5 h，然后轉(zhuǎn)膜，100 V轉(zhuǎn)1.5 h，TBST洗3次，每次10 min，5%的脫脂奶粉封閉1 h，孵一抗，4 ℃過夜.第2 d用TBST洗3次，每次10 min，室溫孵二抗1 h，TBST洗3次，每次10 min，TBS洗2次，每次10 min，最后ECL顯影.

1.8 統(tǒng)計分析

采用Microsoft office和CorelDRAW X4 SP2繪圖，采用t-test統(tǒng)計數(shù)據(jù).

2 結(jié)果

2.1 PX458-sgRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定

將sgRNA退火后形成的雙鏈與酶切后的PX458連接得到的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)stbl3中，挑取單克隆菌落，進行菌落PCR鑒定，然后送測序.測序結(jié)果顯示，4對sg-RNA都與PX458載體正確連接.

M) 15 Kb DNA marker; 1～3) PX458-sgRNA-1; 4～6) PX458-sgRNA-2;7,8) PX458-sgRNA-3; 9,10) PX458-sgRNA-4圖2 構(gòu)建敲除表達載體的菌落PCR和測序結(jié)果Fig.2 Colony PCR and sequencing results of constructed expression vectors

2.2 構(gòu)建MTMR14基因敲除的293T細胞系

將測序正確的PX458-sgRNA表達載體轉(zhuǎn)染至293T細胞中，分選單細胞到96孔板，待其擴大培養(yǎng)后，用測序和錯配酶酶切的方法對細胞的基因組序列進行分析鑒定，用Western Blotting檢測MTMR14蛋白的表達，結(jié)果見圖3.由圖3可見：sgRNA-H1-2, sgRNA-H8-1, sgRNA-H11-1這3株細胞的基因均被編輯了，且均能被錯配酶切開，但僅sgRNA-H1-2的MTMR14的表達明顯減少了，sgRNA-H8-1, sgRNA-H11-1均無明顯變化.

A)分選細胞的測序比對；B)分選細胞的錯配酶鑒定:M) 100 bp DNA marker,1)陽性對照,2)陰性對照,3～5)分別為sgRNA-H1-2, sgRNA-H8-1, sgRNA-H11-1;C)分選細胞Western Blotting檢測MTMR14的表達圖3 分選的293T細胞的基因序列和蛋白表達分析鑒定Fig.3 Gene sequencing and protein expression analysis of sorted 293T cells

2.3 構(gòu)建敲除MTMR14基因的A549細胞株

用工具細胞293T構(gòu)建基因敲除細胞，建立基因敲除細胞系的平臺并篩選有效的sgRNA，為研究MTMR14基因在肺癌細胞中的作用，以A549肺癌細胞為研究對象，分選A549細胞的基因序列和蛋白表達分析鑒定結(jié)果見圖4.由圖4可知： PX458-sgRNA-2能使MTMR14蛋白的表達量減少，故用PX458-sgRNA-2表達載體轉(zhuǎn)染至A549細胞中，通過流式細胞儀將單個帶綠色熒光的細胞篩選至96孔板中，通過測序及Western Blotting檢測獲得了一株基因敲減的A549細胞.

A)分選A549細胞的測序比對; B)分選細胞Western Botting檢測MTMR14的表達圖4 分選的A549細胞的基因序列和蛋白表達分析鑒定Fig.4 Gene sequencing and protein expression analysis of sorted A549 cells

2.4 MTMR14表達量的減少促進A549 的增殖

研究表明：在MEFs(小鼠胚胎成纖維細胞)[10]和小鼠成肌細胞[11]中，MTMR14的缺失會促進細胞的增殖，推測在A549細胞中，MTMR14表達量的減少影響細胞增殖，故設(shè)計了MTT實驗進行驗證，.結(jié)果見圖5.由圖5可知：MTMR14表達量的減少促進了A549 細胞的增殖.

圖5 MTMR14表達量的減少促進A549細胞的增殖Fig.5 Reduction of MTMR14 expression promotes the proliferation of A549 cells

2.5 流式細胞術(shù)檢測非同步化 A549 細胞周期

細胞增殖的快慢與細胞周期的進程密切相關(guān)[12]，采用流式細胞儀進一步檢測MTMR14表達的減少對A549細胞周期進程的影響，結(jié)果見圖6和表2.由圖表可知：在非同步情況下，兩組處于各時期細胞的比例基本相當，細胞周期無明顯變化.

A)對照組; B)敲減組圖6 流式細胞儀檢測非同步化的A549 細胞的細胞周期Fig.6 Flow cytometry analysis to detect the cell cycle of asynchronous A549 cells

不同分組不同細胞周期細胞百分比/%G1G2SG1/ G2Control68.7718.4212.811.70KD64.2718.4517.281.75

2.6 Real-time PCR 檢測細胞周期關(guān)鍵性調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄水平

細胞周期的進程受到細胞周期調(diào)控因子的嚴密調(diào)控，分別選擇CyclinD1和CyclinE這2個正調(diào)控因子，P21和P27這2個負調(diào)控因子，Real-time PCR檢測其mRNA表達水平.結(jié)果見圖7.如圖7所示：細胞周期正調(diào)控因子CyclinD1,CyclinEmRNA表達水平顯著增加，細胞周期負調(diào)控因子P21,P27 mRNA表達水平顯著降低.

*P<0.05, **P<0.01,vs Control圖7 兩組細胞中細胞周期調(diào)控因子的mRNA表達Fig.7 mRNA expression of cell cycle regulatory factors in two groups of cells

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是近年來備受關(guān)注的一項基因編輯技術(shù)，相對于之前的鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)及類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)，CRISPR/Cas9技術(shù)編輯效率更高效，操作更簡單，成本更低.它只需針對目的基因設(shè)計對應(yīng)的sgRNA，將其連接到一個載體上，轉(zhuǎn)入研究對象中，再對其進行PCR和Western Blotting檢測.以上這些優(yōu)點使得CRISPR/Cas9技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用.本文采用CRISPR/Cas9技術(shù)和流式細胞分選結(jié)合的方法，避開了病毒感染和有限稀釋，確保了實驗安全，能夠更快速、輕松、高效地獲得基因敲除細胞.

MTMR14是一種新型的磷酸肌醇磷酸酶，研究表明：MTMR14缺失會導致小鼠骨骼肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)Ryanodine通道開放，促進內(nèi)鈣釋放，引起許多肌肉疾病，如中央核肌病、肌無力、肌肉疲勞和骨骼肌細胞衰老等[13, 14].MTMR14對細胞自噬和調(diào)節(jié)衰老有一定作用[10,15,16]，MTMR14缺失會促進MEFs細胞增殖[10].基于以上研究，本文先利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了基因敲除的293T細胞，293T是一個工具細胞，易于轉(zhuǎn)染和操作；再以肺癌細胞A549為研究對象，構(gòu)建了MTMR14基因敲減的A549細胞系，并對野生型和MTMR14敲減的A549細胞進行一系列表型分析.結(jié)果表明：MTMR14表達減少明顯地促進A549細胞增殖，野生型和敲減型細胞在各時期所占的細胞比無差異，說明在非同步化的情況下，MTMR14的減少對細胞周期無明顯影響.通過Real-time PCR 檢測發(fā)現(xiàn)細胞周期正調(diào)控因子CyclinD1,CyclinEmRNA表達水平顯著增加，細胞周期負調(diào)控因子P21,P27 mRNA表達水平顯著降低.

綜上所述，本文構(gòu)建了MTMR14基因敲減的細胞系，為基因功能研究提供了工具和方法；初步發(fā)現(xiàn)在肺癌細胞中MTMR14的減少促進了細胞增殖，為后續(xù)深入研究其功能奠定了基礎(chǔ).