李麗華，余婷婷，丁彩梅，張潤武，楊冬梅 ，王紅英， 白 經(jīng) ，普 冬

(云南省昆明市第三人民醫(yī)院檢驗科 650041)

隨著艾滋病(AIDS)防治工作的不斷強化，AIDS實驗室檢測技術(shù)也在不斷發(fā)展，根據(jù)《艾滋病資料手冊》規(guī)定[1]，接受治療的AIDS患者必須定期檢測病毒載量，人類免疫缺陷病毒(HIV)載量檢測被認為是目前預(yù)示疾病演變、提示開始臨床治療和評估療效的有效指征[2]。同時HIV病毒載量檢測還可作為靈敏的HIV早期感染的診斷方法[3-4]，特別是對HIV陽性產(chǎn)婦的嬰兒和處于HIV抗體窗口期的感染者等特殊免疫性個體具有較好的提示作用[5-6]。核酸高精度定量檢測儀是獲得準確臨床實驗室結(jié)果的關(guān)鍵因素，減少了核酸手工提取中容易出現(xiàn)的操作失誤，增加了核酸提取的一致性和重復(fù)性[7]。當(dāng)前常用的核酸高精度定量檢測技術(shù)包括雅培m2000全自動分析系統(tǒng)、羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀、梅里埃Nuclisens EasyQ HIV-1及西門子公司的Versant HIV-1。國內(nèi)已有關(guān)于幾種檢測技術(shù)的相關(guān)研究[8]，但同時對雅培m2000全自動分析系統(tǒng)和羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀進行HIV-1病毒載量定量檢測的研究鮮見報道。本研究通過采用雅培m2000全自動分析系統(tǒng)和羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀高精度定量檢測方法，對30例HIV-1病毒載量結(jié)果不同患者標(biāo)本進行檢測比較，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究涉及的標(biāo)本為2017年1-6月到本院就診的，免疫印跡法HIV-1確證試驗結(jié)果為陽性的AIDS患者標(biāo)本30例。所選取患者的HIV-1病毒載量從0～105copy/mL均有覆蓋。

1.2標(biāo)本采集 采集患者血液后立即放入有乙二胺四乙酸三鉀試管中，充分混勻。然后將全血在4 h內(nèi)離心并分離血漿，存放于-70 ℃冰箱內(nèi)，以備檢測HIV-1病毒載量使用。

1.3儀器與試劑 采用雅培m2000全自動分析系統(tǒng)、Abbott RealTime HIV-1 Kit檢測試劑盒及羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析系統(tǒng)、羅氏AmpliPrep/TaqMan HIV-1 Test V2.0試劑盒同時進行檢測。所有檢測試劑盒均在有效期內(nèi)，操作嚴格按照試劑盒和儀器說明書進行。

1.4方法

1.4.1雅培m2000全自動分析系統(tǒng)檢測方法 Abbott m2000sp系統(tǒng)采用多種操作方法從血漿標(biāo)本中純化核酸，采用Abbott內(nèi)部研發(fā)的化學(xué)試劑，以未包被的氧化鐵磁珠作為捕獲介質(zhì)從0.6 min血漿或血清標(biāo)本中提取RNA，m2000sp將磁珠、細胞裂解緩沖液和患者標(biāo)本混合，將標(biāo)本在50 ℃細胞裂解緩沖液中孵育20 min，細胞裂解緩沖液裂解細胞并釋放出RNA，RNA被吸附到磁珠上，通過優(yōu)化磁鐵吸附過程在單管中進行磁珠捕獲，清洗磁珠以便除去未結(jié)合的血漿或血清標(biāo)本組分，重復(fù)捕獲和清洗過程，從而除去其他多余的標(biāo)本組分、污染物和抑制劑，然后在75 ℃低水平磷酸鹽緩沖液中孵育20 min，從磁珠上洗脫獲得RNA，加水孵育，將緩沖液稀釋至極低水平，磁珠被磁鐵吸附，核酸被轉(zhuǎn)移到96深孔板中，獲得聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)板，密封并裝入Abbott m2000rt進行實時PCR檢測。

1.4.2羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀檢測方法 AmpliPrep/TaqMan儀器可自動制備標(biāo)本。該程序可以處理850 μL血漿標(biāo)本。在稍高的溫度下，蛋白酶和裂解液/結(jié)合緩沖液與標(biāo)本孵育，裂解HIV-1病毒顆粒，釋放出核酸，并保護HIV-1 RNA免受血漿中RNA酶的破壞。蛋白酶和已知拷貝數(shù)的HIV-1定量標(biāo)準物QS帶盔甲RNA與裂解試劑和磁性玻璃珠一起加入到每一份標(biāo)本中?；旌衔锝?jīng)孵育后，HIV-1 RNA和HIV-1 QS RNA結(jié)合于磁性玻璃珠表面。未結(jié)合的一些物質(zhì)，如鹽、蛋白質(zhì)及其他細胞雜質(zhì)經(jīng)洗滌磁性玻璃珠后被除去。經(jīng)磁性玻璃珠分離和完全洗滌步驟，吸附的核酸在較高溫度下洗脫下來。樣品處理后釋放出來的HIV-1 RNA及HIV-1 QS RNA被加入至擴增混合物中，并被轉(zhuǎn)移至COBAS TaqMan分析儀，HIV-1靶RNA及HIV-1 QS RNA隨之進行反轉(zhuǎn)錄、擴增，并經(jīng)切除靶特異的和QS特異的雙標(biāo)記寡核苷酸探針完成實時定量檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件包進行數(shù)據(jù)處理，并進行繪圖和比較分析，兩組間計量資料采用配對t檢驗,相關(guān)分析采用Pearson分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩種儀器檢測HIV-1病毒載量與外周血CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+結(jié)果 見表1。30例患者HIV-1病毒載量檢測結(jié)果顯示，雅培m2000全自動分析系統(tǒng)陽性檢出率為100%，檢測結(jié)果均值為(2.990±0.284)log copy/mL；羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀陽性檢出率也為100%，檢測結(jié)果均值為(3.100±0.244)log copy/mL，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.466,P>0.05)。

表1 兩種儀器檢測HIV-1病毒載量與外周血CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+結(jié)果

續(xù)表1 兩種儀器檢測HIV-1病毒載量與外周血CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+結(jié)果

2.2兩種儀器檢測HIV-1病毒載量與外周血CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+的相關(guān)性 見表2。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，雅培m2000全自動分析系統(tǒng)、羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀HIV-1病毒載量檢測結(jié)果均與CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+呈明顯直線負相關(guān)。

表2 兩種儀器檢測HIV-1病毒載量與外周血CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+的相關(guān)性

2.3兩種儀器測得病毒載量之間的相關(guān)性分析 見圖1。雅培m2000和羅氏AmpliPrep/TaqMan兩種全自動分析系統(tǒng)檢測的病毒載量呈線性關(guān)系(r=0.968，P<0.001)。

圖1 兩種儀器測得HIV病毒載量相關(guān)性分析

3 討 論

雅培m2000全自動分析系統(tǒng)和羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀均能夠檢測所有M組和O組的HIV-1毒株及非B亞型HIV-1的病毒載量，這些檢測系統(tǒng)提供了一種既快速又高度準確的檢測方法，有助于患者接受最有效的治療[8]。

雅培m2000和羅氏AmpliPrep/TaqMan兩種檢測系統(tǒng)在檢測原理、方法上都基本相似，均是對HIV-1病毒載量進行定量高精度檢測，其檢測結(jié)果在AIDS抗病毒治療過程中可作為臨床醫(yī)生制訂用藥方案的參考指標(biāo)，確定藥物耐受水平，也可為更換治療方案或?qū)ΜF(xiàn)有方案進行改進做準備。本研究對30例AIDS患者血漿采用雅培m2000全自動分析系統(tǒng)和羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀同時測定病毒載量，所選患者的HIV-1病毒載量從0～105copy/mL均有覆蓋，所有標(biāo)本兩種方法陽性檢出率均為100%，特異度和重復(fù)性、陽性檢出率一致，兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示兩種檢測系統(tǒng)均有較高的靈敏度。

HIV載量反映的是HIV在體內(nèi)復(fù)制的數(shù)量，CD4+T細胞數(shù)指HIV感染靶細胞的數(shù)量，預(yù)示著人體不同的免疫水平[9]，CD4+T細胞數(shù)低下或降低提示患者病情惡化。因此，可通過分析病毒載量和CD4+T細胞數(shù)變化來了解抗病毒療效。本研究結(jié)果顯示，雅培m2000全自動分析系統(tǒng)和羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀檢測的HIV-1病毒載量均與CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+呈明顯負相關(guān)，當(dāng)病毒載量檢測值較低時，CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+一般較高，反之，當(dāng)病毒載量值升高時，CD4+T細胞數(shù)及CD4+/CD8+呈下降趨勢，這與路新利等[10]和李玲等[11]的研究結(jié)果相一致。

雅培m2000和羅氏AmpliPrep/TaqMan兩種檢測系統(tǒng)也存在一定的差異。主要表現(xiàn)在：雅培m2000全自動分析系統(tǒng)在操作時可用標(biāo)本采集原始管直接上機，避免手工混合操作，相對于羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀手工操作標(biāo)本加載和卸載，消除了交叉污染，同時降低了操作時工作人員易造成的誤差。雅培m2000全自動分析系統(tǒng)可開放模式，一次提取，多次應(yīng)用，便于實時復(fù)查，可用于其他如耐藥性分析及分型等，大大節(jié)約了試驗成本。羅氏AmpliPrep/TaqMan全自動分析儀提供了整合的自動化標(biāo)本制備系統(tǒng)，使整個標(biāo)本檢測過程自動化，提高了操作流程的效率。雅培m2000系統(tǒng)的m2000sp和m2000rt 2個部分是分開的，在安裝上就可遵循分子生物實驗室的分區(qū)理念，而羅氏AmpliPrep和TaqMan兩種分析系統(tǒng)是連在一起的，對實驗室場地、環(huán)境要求相對較高，但操作過程相對易于掌握。

當(dāng)然，兩種全自動分析系統(tǒng)也有各自的不足之處，由于是高精度的定量分析系統(tǒng)，兩種分析系統(tǒng)均需使用原裝配套試劑及耗材，在帶來穩(wěn)定可靠結(jié)果的同時檢測成本也相對較高，耗材消耗量較大。但是，隨著聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署提出“2030年終結(jié)艾滋病”愿景的提出，以及2020年實現(xiàn)“3個90%”防治目標(biāo)，即：90%的感染者通過檢測知道自己的感染狀況，90%已經(jīng)診斷的感染者接受抗病毒治療,90%接受抗病毒治療的感染者病毒得到抑制，HIV RNA載量的高精度檢測將具有重要意義。兩種精準的定量分析系統(tǒng)對病情的準確判斷，特別是對HIV陽性產(chǎn)婦的嬰兒和處于HIV抗體窗口期的感染者等特殊免疫個體[5-6]，在其感染的早期診斷中發(fā)揮了重要作用。此外，兩種精準的定量分析系統(tǒng)還能指導(dǎo)AIDS抗病毒治療的療效監(jiān)控，以盡量清除病毒或抑制病毒復(fù)制[12]。AIDS患者在很大程度上依賴HIV RNA載量的精確測定，因此，只有采用高精度的檢測方法才能為臨床醫(yī)生提供更準確可靠的AIDS治療依據(jù)。