彭述珊 岳 靜

(麗水市第二人民醫(yī)院精神科五病區(qū)，浙江 麗水 323000)

臨床調(diào)查顯示，糖尿病患者抑郁癥發(fā)病率為非糖尿病患者2～3倍，其中20%～30%的糖尿病患者共病抑郁癥〔1，2〕。因此，探討糖尿病合并抑郁癥的發(fā)病機制，做好防治具有重要意義〔3〕。柴胡舒肝丸是由柴胡、香附、川芎、陳皮、芍藥、枳殼、炙甘草、黨參、半夏、白芍等組成，具有疏肝解郁、行氣止痛功效，主要用于治療肝郁證的一種常用方劑。目前，臨床上對于柴胡疏肝丸用于糖尿病合并抑郁癥相關(guān)作用機制報道甚少。本研究通過建立糖尿病合并抑郁大鼠模型，探討柴胡舒肝丸對其行為學(xué)表現(xiàn)及認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體重180～200 g，來自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2013-0004。柴胡疏肝丸(柴胡、香附、川芎、陳皮、芍藥、枳殼、炙甘草、黨參、半夏、白芍等組成)，鹽酸氟西汀膠囊(法國Patheon公司)。

1.2主要試劑 RIPA裂解液和Trizol試劑(Life Technolgies公司)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體及兔抗鼠JNK單克隆抗體(Abcam公司)。

1.3主要儀器 動物學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)(Viewpoint公司)，實時熒光定量PCR儀(Roche公司)，電泳儀(Bio-Rad公司)。

1.4糖尿病合并抑郁癥模型制備 采用14 d高脂灌胃聯(lián)合鏈脲佐菌素尾靜脈注射(38 mg/kg)造糖尿病模型，鏈脲佐菌素注射3 d后，大鼠禁食不禁水6 h，測定大鼠空腹血糖值。糖尿病模型大鼠成功標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥16.0 mmol/L。繼續(xù)給予糖尿病模型大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激，條件包括禁食或禁水24 h、水浴4 min、傾籠24 h、50 V電擊3 min、潮濕墊料24 h、光照或黑暗24 h、夾尾1 min，每日采用1～2種進(jìn)行刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，并且電擊、夾尾軀體應(yīng)激每周限1次，共28 d。

1.5實驗分組及給藥 按照隨機表法將80只大鼠隨機分為模型組、鹽酸氟西汀組、柴胡疏肝丸組和正常組，各20只。模型組和正常組給予等劑量蒸餾水灌胃，每日1次；鹽酸氟西汀組給予鹽酸氟西汀膠囊1.8 mg/kg灌胃，每日1次；柴胡疏肝丸組給予柴胡舒肝丸1 ml/100 g灌胃，每日1次。連續(xù)灌胃28 d。末次給藥后大鼠禁食12 h，給予大鼠3 ml/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取大鼠腦，剝離海馬組織，放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6Western印跡檢測鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 取上述海馬組織，加入細(xì)胞裂解液，放置于冰上繼續(xù)勻漿，離心10 min，取上清液制備組織蛋白提取液檢測，以β-actin作為內(nèi)參，測定蛋白表達(dá)灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7RT-PCR檢測海馬JKN、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá) 取上述海馬組織，加入Trizol試劑，置于冰上進(jìn)行勻漿，海馬組織總RNA提取嚴(yán)格參照RNA提取步驟提取，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。PCR擴增JNK、Bax和Bcl-2基因產(chǎn)物。基因表達(dá)差異數(shù)據(jù)采用2-△△Ct分析。RT-PCR引物序列：JNK上游：5′-AGGAATAGTGTGTGCAGCTTATG-3′，下游：5′-CTTCTAGGGATTTCTGTGGTGTG-3′；Bax上游：5′-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3′，下游：5′-GATCATCCTCTGCAGCTCC-3′；Bcl-2上游：5′-TGTGTGGAGAGCGTCAACCG-3′，下游：5′-TCCACAAAGGCGTCCCAGC-3′；β-actin上游：5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′，下游：5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′；反應(yīng)條件95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，共45個循環(huán)。

1.8行為學(xué)測試及認(rèn)知功能測試

1.8.1行為學(xué)測試 ①強迫游泳實驗：將大鼠放入高為50 cm、直徑為20 cm的圓柱形水缸中，水深40 cm左右，隨機選擇大鼠，每次觀察3只，采用雙盲法檢測。實驗開始后60 s為適應(yīng)時間，適應(yīng)結(jié)束后記錄5 min內(nèi)大鼠不動時間。②Open-field測試：采用長為80 cm、寬為80 cm、高為40 cm的一個敞箱，底面平均劃分為25個小方格。將大鼠于實驗開始后從敞箱中央放入，觀察且記錄大鼠4 min內(nèi)垂直豎立次數(shù)及水平運動格數(shù)，計算垂直和水平得分的總和。

1.8.2認(rèn)知功能測試 采用Morris水迷宮測試系統(tǒng)進(jìn)行測試，包括圓形水池(直徑150 cm)、平臺(直徑10 cm、高15 cm)，平臺表面低于水面2 cm，水迷宮記錄分析系統(tǒng)訓(xùn)練4 d。于大鼠第5天進(jìn)行隱藏平臺獲得實驗，記錄潛伏期，考察認(rèn)知能力。于大鼠第6天撤去平臺，進(jìn)行空間搜索實驗，測試記憶能力。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)比較 與正常組比較，其余各組Bax和JNK表達(dá)明顯升高而Bcl-2 mRNA明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸氟西汀組和柴胡疏肝丸組Bax和JNK mRNA表達(dá)明顯降低而Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)；柴胡疏肝丸組Bax和JNK mRNA表達(dá)明顯低于鹽酸氟西汀組而Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯高于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，其余各組Bax和JNK蛋白表達(dá)明顯升高而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸氟西汀組和柴胡疏肝丸組Bax和JNK蛋白表達(dá)明顯降低而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；柴胡疏肝丸組Bax和JNK蛋白表達(dá)明顯低于鹽酸氟西汀組而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)比較

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與鹽酸氟西汀組比較:3)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)比較

2.3各組大鼠行為學(xué)測試比較 與正常組比較，其余各組自主活動次數(shù)明顯減少而不動時間明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸氟西汀組和柴胡疏肝丸組自主活動次數(shù)明顯增加而不動時間明顯減少(P<0.05)；柴胡疏肝丸組自主活動次數(shù)明顯多于鹽酸氟西汀組而不動時間明顯少于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠行為學(xué)測試比較

2.4各組大鼠Morris水迷宮測試比較 與正常組比較，其余各組中心區(qū)域停留和穿越目標(biāo)區(qū)次數(shù)明顯減少而逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸氟西汀組和柴胡疏肝丸組中心區(qū)域停留和穿越目標(biāo)區(qū)次數(shù)明顯增加而逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；柴胡疏肝丸組中心區(qū)域停留和穿越目標(biāo)區(qū)次數(shù)明顯多于鹽酸氟西汀組而逃避潛伏期明顯短于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠Morris水迷宮測試比較

3 討 論

糖尿病主要是由多種引起導(dǎo)致的以慢性高血糖為特征的一種代謝紊亂，抑郁癥是其危害最大的慢性并發(fā)癥〔4，5〕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病合并抑郁癥是由于肝氣郁結(jié)、情志不舒漸引起五臟不和，化火、耗氣、瘀阻、生痰和傷陰等所致，屬“郁癥”范疇，應(yīng)以疏肝理氣為主要治療法則〔6～8〕。柴胡舒肝丸是純中藥制劑，組成主要包括柴胡、香附、川芎、陳皮、芍藥、枳殼、炙甘草、黨參、半夏、白芍，其中柴胡具有疏肝解郁功效，香附具有理氣解郁功效，川芎具有活血祛瘀、行氣開郁功效，陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰功效，芍藥具有養(yǎng)血和營、緩急止痛功效，枳殼具有理氣寬中功效，炙甘草具有調(diào)和諸藥功效，黨參具有補中益氣、健脾功效，半夏具有燥濕化痰功效，白芍具有養(yǎng)血柔肝、緩中止痛功效?？v觀全方可奏疏肝理氣功效。強迫游泳實驗主要使動物處于無可回避的一個壓迫環(huán)境，一段時間后動物表現(xiàn)出典型的不動狀態(tài)，即處于一種行為絕望狀態(tài)，該實驗方法廣泛用于抗抑郁藥物的研究〔9〕。Open-fied實驗主要是評價動物在新異環(huán)境中自主行為、緊張度及探究行為常用的一種行為學(xué)方法。本研究表明，通過柴胡舒肝丸干預(yù)后可明顯增加糖尿病合并抑郁大鼠自主活動次數(shù)而減少大鼠不動時間。Morris水迷宮試驗主要用于實驗動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的考察，該試驗方法廣泛應(yīng)用于與大腦海馬組織病變相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究〔10〕。本研究表明，通過柴胡舒肝丸干預(yù)后可明顯增加糖尿病合并抑郁大鼠中心區(qū)域停留和穿越目標(biāo)區(qū)次數(shù)及縮短逃避潛伏期。

已有研究報道顯示，在海馬神經(jīng)元中JNK信號通路具有重要作用，且糖尿病和抑郁癥導(dǎo)致的海馬損傷都與海馬JNK信號通路異?；罨霸斐煽刂频蛲龅南嚓P(guān)蛋白異常表達(dá)相關(guān)〔11〕。在多種疾病介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中JNK激活發(fā)揮重要作用。Bcl-2是一種抗細(xì)胞凋亡因子，具有抑制細(xì)胞凋亡作用，且可通過抑制氧自由基或者抗氧化作用產(chǎn)生來阻止細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步阻斷細(xì)胞死亡級聯(lián)〔12〕。Bax是與Bcl-2功能相反的一種基因，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，二者平衡可決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡〔13〕。本研究表明，通過柴胡舒肝丸干預(yù)后可下調(diào)糖尿病合并抑郁大鼠Bax和JNK表達(dá)從而上調(diào)Bcl-2表達(dá)，而抑制海馬神經(jīng)元凋亡。