郭偉峰 黃 弘 何約明 莊錫彬

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，福建 泉州 362000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床常見(jiàn)的呼吸道疾病，主要表現(xiàn)為持續(xù)及進(jìn)行性加重的氣流受限及通氣功能障礙。COPD實(shí)質(zhì)是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)刺激大量的炎性介質(zhì)釋放，引起黏液分泌增加，加重炎癥反應(yīng)和氣道阻塞癥狀〔1，2〕，患者常伴免疫功能異常，尤其是細(xì)胞免疫功能紊亂。氨茶堿為茶堿與乙二胺的復(fù)鹽，茶堿可增強(qiáng)膈肌收縮力，乙二胺可增強(qiáng)水溶性，廣泛用于COPD急性加重期或穩(wěn)定期患者的治療中〔3〕。氨茶堿有抑制炎癥反應(yīng)與調(diào)節(jié)免疫功能的作用，但具體機(jī)制尚不清楚。本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討氨茶堿對(duì)COPD模型大鼠炎性因子及T細(xì)胞亞群的影響，分析氨茶堿對(duì)COPD的防治作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠8只，6～8周齡；體質(zhì)量200～250 g，平均(220.24±20.12)g；購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)：SCXK20151210)；飼養(yǎng)條件：室溫(25.21±1.24)℃，相對(duì)濕度50%～60%，常規(guī)進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2主要材料 氨茶堿片(上海信誼天平藥物有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31021799，規(guī)格0.1 g×48片)；辛伐他汀片(國(guó)藥集團(tuán)工業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20103418，規(guī)格20 mg×10片)；脂多糖(LPS，美國(guó)Sigma公司)；戊巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31021724，規(guī)格100 mg)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑(北京晶美生物工程有限公司)。

全自動(dòng)生化分析儀：日本日立7600型；流式細(xì)胞儀：貝克曼庫(kù)爾特Gallios型；高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)TGL-16型；恒溫冰箱：天津泰斯特儀器有限公司HH-W21-60型；光學(xué)相差顯微鏡：日本Olympus公司CKX41型；病理圖像分析系統(tǒng)：Germany公司Leica Qwin standard2.8。

1.3動(dòng)物分組及模型制作 按照隨機(jī)數(shù)字表法將32只大鼠分為對(duì)照組、模型組、氨茶堿組和辛伐他汀組各8只。COPD大鼠模型的制備采用氣管注射LPS合并熏香煙法〔4〕。除對(duì)照組外，其余三組大鼠于第1、14天，用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，將靜脈套管針快速插入大鼠氣管，注入LPS 200 μg/200 μl，隨后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)，使LPS均勻分布于兩肺。第30～56天(第42天除外)，每日將大鼠置于60 cm×50 cm×40 cm的密封箱內(nèi)，向密封箱中持續(xù)注入香煙煙霧30 min，上、下午各注入1次。

1.4藥物干預(yù) 除煙熏時(shí)間外，所有大鼠在相同環(huán)境下飼養(yǎng)。建立大鼠COPD模型后，模型組用生理鹽水1 ml/100 g灌胃，1次/d；氨茶堿組用氨茶堿50 mg/kg灌胃，1次/d；辛伐他汀組用辛伐他汀5 mg/kg灌胃，1次/d。對(duì)照組用生理鹽水1 ml/100 g灌胃，1次/d。大鼠均連續(xù)灌胃2個(gè)月。

1.5肺組織病理學(xué)檢查 大鼠心臟采血法致死后，將右肺中下葉置于甲醛溶液中浸泡24 h，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀(guān)察肺組織病理改變。

1.6炎性因子檢測(cè) 大鼠心臟采血法致死后，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)6 ml，1 000 r/min離心15 min取上清液，采用ELISA法檢測(cè)BALF中白細(xì)胞介素(IL)-8、IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量。

1.7外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 大鼠心臟采血法致死后，采集腹主動(dòng)脈血4 ml分離血清后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+，計(jì)算CD4+/CD8+值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學(xué)改變 對(duì)照組大鼠支氣管肺組織結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，纖毛間夾雜少量杯狀細(xì)胞，管壁可見(jiàn)少數(shù)散在淋巴細(xì)胞。模型組肺組織支氣管上皮細(xì)胞部分脫落，可見(jiàn)纖毛粘連或壞死，黏膜下層與肌層出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管平滑肌、肺泡隔明顯增厚，管腔內(nèi)出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與黏液分泌物，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。辛伐他汀組、氨茶堿組肺組織病變明顯好轉(zhuǎn)。見(jiàn)圖1。

2.2各組炎性因子水平比較 模型組BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量均明顯高于對(duì)照組(P<0.001)；辛伐他汀組、氨茶堿組BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05)；氨茶堿組BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明顯低于辛伐他汀組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 各組肺組織病理改變(HE，×100)

組別IL-8(ng/L)IL-17(ng/L)TNF-α(ng/L)T淋巴細(xì)胞總數(shù)(個(gè))CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+對(duì)照組338.17±20.5955.82±3.01126.83±8.472 815.34±305.5635.71±2.3910.61±0.563.39±0.20模型組602.86±45.731)90.04±7.121)210.59±11.261)1 742.81±200.782)32.18±2.572)12.49±0.732)2.54±0.262)辛伐他汀組482.79±26.053)79.13±5.463)189.47±6.833)1 938.73±214.653)33.54±2.243)11.73±0.713)2.97±0.283)氨茶堿組457.32±21.743)4)62.35±5.083)4)156.06±8.523)4)2 209.45±220.973)4)34.69±2.383)4)11.02±0.593)4)3.26±0.253)4)F/P值8.695/0.0027.324/0.0089.112/0.0006.345/0.0102.456/0.0285.321/0.0166.132/0.011

與對(duì)照組比較：1)P<0.001,2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05；與辛伐他汀組比較：4)P<0.05

2.3各組外周血T淋巴細(xì)胞水平比較 模型組T淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+、CD4+/CD8+均明顯低于對(duì)照組，CD8+高于對(duì)照組(P<0.05)；辛伐他汀組、氨茶堿組T淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯高于模型組，CD8+明顯低于模型組(P<0.05)；氨茶堿組T淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯高于辛伐他汀組，CD8+明顯低于辛伐他汀組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3 討 論

COPD是一種以持續(xù)氣流受限為特征的慢性肺部疾病，與反復(fù)煙霧等有害顆?；驓怏w對(duì)肺組織和氣道的慢性刺激及由此引起的異常炎性反應(yīng)有關(guān)，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題〔5〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，氨茶堿有促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的作用，同時(shí)具有抑制炎癥反應(yīng)與調(diào)節(jié)免疫的作用，可能與抑制炎性細(xì)胞的生成與釋放有關(guān)〔6〕。在臨床實(shí)踐中，氨茶堿是治療COPD穩(wěn)定期及急性加重期的常用藥物，診斷、處理和預(yù)防全球策略(2013年版)中將茶堿類(lèi)藥物作為二線(xiàn)治療藥物〔7〕。

COPD是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，IL-17參與中性粒細(xì)胞活化、遷移、聚集；IL-8激活趨化嗜中性粒細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)炎癥過(guò)程；TNF-α是一種具有調(diào)節(jié)免疫與炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，無(wú)論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是臨床研究均表明，COPD大鼠或患者BALF中血清IL-17、IL-8、TNF-α含量均明顯升高〔8，9〕，本研究也證實(shí)了該觀(guān)點(diǎn)。辛伐他汀可抑制肺部及系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，減輕肺氣腫程度，延緩肺功能下降〔10〕。氨茶堿的藥理作用主要來(lái)自茶堿，茶堿的抗炎作用可能與抑制磷酸二酯酶活性、神經(jīng)肽的釋放、氧自由基等有關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果提示氨茶堿更能有效地抑制COPD模型大鼠炎性因子表達(dá)水平，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也有類(lèi)似的文獻(xiàn)報(bào)道〔7，12〕。

T淋巴細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有識(shí)別和排除抗原、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、參與異常炎癥反應(yīng)的作用。COPD氣道炎癥可分為兩期，初發(fā)期侵犯氣管上皮和黏膜下層，引起中性粒細(xì)胞趨化反應(yīng)和巨噬細(xì)胞吞噬反應(yīng)；隨著疾病繼續(xù)發(fā)展，炎癥向縱深擴(kuò)展，則T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量之間的平衡遭到破壞，CD8+細(xì)胞增多，通過(guò)免疫應(yīng)答引起肺自身抗原-抗體反應(yīng)，進(jìn)而引起肺損傷，導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生〔13〕，T淋巴細(xì)胞亞群中CD8+細(xì)胞增多是COPD的特征性免疫反應(yīng)。李建生等〔14〕發(fā)現(xiàn)，氨茶堿對(duì)COPD穩(wěn)定期大鼠外周血和肺臟局部T淋巴細(xì)胞亞群均具有明顯的調(diào)節(jié)作用，本文研究結(jié)果也支持這一觀(guān)點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，氨茶堿有助于緩解COPD模型大鼠炎癥狀態(tài)，改善機(jī)體免疫功能。但其作用機(jī)制尚未明確，有待于更多的基礎(chǔ)研究與臨床研究去證實(shí)。