吳柳賡 楊林風(fēng) 田 峰 矯亞男 崔換新 柳書云 孫 慧

(青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)內(nèi)科，山東 青島 266000)

粗略估計(jì)胃癌每年可導(dǎo)致全球723 000人死亡〔1〕。據(jù)報(bào)道，約70%的胃癌患者來自發(fā)展國(guó)家〔2〕，其中絕大多數(shù)屬于腺癌，分為腸道型和彌漫型〔3〕。盡管新的臨床、生物和分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提高了胃癌的早期診斷率，但預(yù)后仍不理想〔4〕，會(huì)面臨復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的免疫系統(tǒng)處于免疫抑制狀態(tài)，可能與程序性死亡分子(PD-1)和T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(Tim)3等相關(guān)〔5～8〕。目前，已有文獻(xiàn)對(duì)胃癌患者外周血中CD4/8 T細(xì)胞表面Tim3分子表達(dá)及功能的研究〔9〕，但尚未有Tim3在胃癌患者Vδ2 T細(xì)胞表面的表達(dá)及功能的文獻(xiàn)報(bào)道。本文旨在探討胃癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞表面Tim3的表達(dá)情況及其對(duì)Vδ2 T細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取2015年6月30日至2016年12月31日在青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)內(nèi)科住院并行手術(shù)治療的胃癌患者30例，男21例，女9例，平均年齡(63.03±15.32)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未接受化療、放療或免疫治療；均經(jīng)過組織病理學(xué)診斷為胃癌；知情同意。組織標(biāo)本收集：收取患者癌組織標(biāo)本，并同時(shí)收集20例患者癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照，男11例，女9例，平均年齡(62.91±14.89)歲。組織標(biāo)本離體后于10 min內(nèi)分裝并凍存于液氮中保存，以備使用。

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)獲取方法 于清晨患者空腹?fàn)顟B(tài)下抽取患者外周血10 ml，并用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋1倍。取1支50 ml離心管，先加入10 ml淋巴細(xì)胞分離液，隨后用吸管小心吸取稀釋血液樣本加于分離液面上(稀釋血液∶淋巴細(xì)胞分離液2∶1)，1 800 r/min離心20 min。離心后，離心管中由上至下分為4層(第1層為血漿層，第2層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，第3層為透明分離液層，第4層為紅細(xì)胞層)，用吸管吸取中間白色的淋巴細(xì)胞白膜層到另一15 ml離心管中，向離心管中加入10 ml PBS，混勻細(xì)胞后以1 000 r/min離心10 min，離心后吸棄PBS，并以10 ml PBS重懸細(xì)胞沉淀，再以600 r/min離心8 min，吸棄PBS，獲取的細(xì)胞沉淀即為PBMC用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3Vδ2 T細(xì)胞比例及表面Tim3表達(dá)情況的測(cè)定方法 取1×106個(gè)上述獲取的PBMC于離心管中，加入1 ml含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌2次，每次以600 r/min離心8 min，并棄盡上清，加入0.1 ml含1% BSA的PBS重懸細(xì)胞加入相應(yīng)的抗體(PE anti-CD3、FITC anti-Vδ2 TCR和APC anti-Tim3)，于4℃孵育30 min；孵育結(jié)束后，用1 ml含1% BSA的PBS洗滌2次，600 r/min離心8 min后吸棄上清，采用0.1 ml 1%多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4腫瘤壞死因子(TNF)-α和穿孔素染色方法 預(yù)處理：以適量的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和離子霉素(Ion)于37℃預(yù)處理細(xì)胞6 h；染色：收取預(yù)處理后的細(xì)胞，用1 ml含1% BSA的PBS洗滌2次，按分子免疫組化染色法進(jìn)行CD3和Vδ2的表面染色；染色結(jié)束后以透化液洗滌細(xì)胞2次，離心吸棄上清后加入APC抗-TNF-α和Pecy5抗穿孔素抗體，于室溫下避光孵育30 min后用透化液洗滌2次，棄盡上清，采用0.1 ml 1%多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素分析。

2 結(jié) 果

2.1外周血Vδ2 T細(xì)胞比例比較 健康對(duì)照組外周血Vδ2 T細(xì)胞百分比〔(5.09±1.52)%〕明顯高于胃癌患者〔(0.94±0.48)%，P<0.01〕。

2.2Vδ2 T細(xì)胞表面Tim3表達(dá)情況比較 健康對(duì)照組外周血Vδ2 T細(xì)胞表面Tim3表達(dá)陽性率〔(1.94±0.96)%〕明顯低于胃癌患者〔(7.34±2.71)%，P<0.01〕。

2.3胃癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞比例及Tim3表達(dá)情況與胃癌臨床病理特征關(guān)系 胃癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞比例及表面Tim3表達(dá)與胃癌患者M(jìn)分期及是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與T分期、年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞比例及Tim3陽性表達(dá)與胃癌臨床病理特征關(guān)系

2.4Tim3對(duì)Vδ2 T細(xì)胞功能的影響 健康對(duì)照組Vδ2+TNF-α+細(xì)胞百分比為(31.78±7.94)%，Vδ2+穿孔素+細(xì)胞百分比為(18.94±4.93)%，激活Tim3信號(hào)通路后Vδ2+TNF-α+細(xì)胞百分比為(18.47±5.47)%，Vδ2+穿孔素+細(xì)胞百分比為(9.57±2.58)%，Tim3可顯著抑制Vδ2 T細(xì)胞TNF-α和穿孔素分泌能力(P<0.01)。

3 討 論

Tim家族成員主要包括Tim1、Tim3和Tim4〔10，11〕，而Tim3是新近發(fā)現(xiàn)的Tim家族的一員〔12～14〕。研究發(fā)現(xiàn)〔15～17〕，Tim3在機(jī)體多種腫瘤組織中均有表達(dá)，且與腫瘤患者的預(yù)后及體內(nèi)T細(xì)胞耗竭密切相關(guān)。有研究表明，多種腫瘤組織浸潤(rùn)的CD4/8 T細(xì)胞表面Tim3的表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著升高〔9，18〕。

T細(xì)胞根據(jù)T細(xì)胞受體(TCR)表達(dá)的不同主要分為αβT細(xì)胞和Vδ T細(xì)胞兩個(gè)細(xì)胞亞群〔19〕。Vδ T細(xì)胞只占CD3細(xì)胞的1%～10%〔20〕，Vδ T細(xì)胞可進(jìn)一步分為兩個(gè)細(xì)胞亞群：主要分布于上皮性相關(guān)的淋巴組織中的Vδ1 T細(xì)胞和主要分布于外周血Vδ2 T細(xì)胞〔21，22〕。Vδ2 T細(xì)胞主要參與炎癥反應(yīng)，具有腫瘤殺傷功能，而Vδ1 T細(xì)胞主要具有免疫調(diào)節(jié)功能〔23〕。本研究結(jié)果提示，Tim3可能通過參與胃癌發(fā)生發(fā)展過程中Vδ2 T細(xì)胞功能的耗竭，促進(jìn)了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，而且Tim3可顯著抑制Vδ2 T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌能力和殺傷功能。胃癌患者外周血Vδ2 T細(xì)胞比例的降低及其表面Tim3表達(dá)水平的升高可能與胃癌進(jìn)展密切相關(guān)。