徐代化，歐 軍，陳深樹，徐期林，焦臺風(fēng)，程良紅，陳垚翰

(1.廣東南天司法鑒定所，廣東 深圳 518003; 2. 深圳黑爾格科技有限公司，廣東 深圳 518109)

近年來毛發(fā)中精神藥物的檢測領(lǐng)域引起了世界各國科學(xué)家越來越多的關(guān)注[1]. 毛發(fā)的檢測被廣泛應(yīng)用于人類行為毒理學(xué)、犯罪刑偵與毒品成癮、藥物濫用與慢性中毒的診斷、死后毒理學(xué)、性犯罪、治療合規(guī)控制等領(lǐng)域[2].

高效高通量的毛發(fā)中精神藥物檢測技術(shù)的研究以及用藥頻度和用藥史與毛發(fā)中精神藥物含量的相關(guān)性研究近年來研究較為關(guān)注. 數(shù)篇綜述論文總結(jié)了毛發(fā)中精神藥品檢測方法、毛發(fā)樣品的清洗和提取方法[3]、儀器檢測方法[4-6]和毛發(fā)檢測應(yīng)用[7]等.

2014年臺灣中山醫(yī)科大學(xué)的Chang[8-9]等開發(fā)了一種基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的高通量檢測方法, 可以同時檢測冰毒(MA)、苯丙胺(AMP)、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亞甲基二氧苯丙胺(MDA)及氯胺酮，檢出限在0.5～5.0 pg/mg之間.

2015年韓國成均館大學(xué)Lee[10]發(fā)展了一種基于LC-MS/MS的毛發(fā)中具有高風(fēng)險濫用勃起功能障礙藥物的檢測方法，可以檢測包括米羅那非、西地那非、他達拉非、烏地那非和伐地那非以及對應(yīng)代謝物，并用于監(jiān)控該類藥物的濫用. 另一種基于LC-MS/MS高效液相檢測毛發(fā)樣本中常見毒品的方法被報道，該方法可以同時檢測15種常見毒品[11]. 香港科技大學(xué)Zhu[12]報道了使用基于納米微流控芯片與LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)同時檢測8種常見毒品及其代謝物的方法，該方法能高效快速地檢測出毛發(fā)中的目標(biāo)化合物.

盡管毛發(fā)中精神藥物的測定方法研究取得了一定進展，但是目前的方法都只能同時檢測少數(shù)常見幾類精神藥物，這無法滿足吸毒成癮認(rèn)定和戒毒監(jiān)管中精準(zhǔn)高效的檢測需求. 本文旨在開發(fā)一種具有普遍適用性的毛發(fā)中精神藥物的檢測方法，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)進行檢測,能夠?qū)γl(fā)中40種常見精神藥物進行定性和定量測定.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器: Agilent 1290-6470 Triple Quad 高效液相-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，Cenece@ TDZ5-WS離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)，Vortex kylin-bell@5旋渦混合儀(美國)，國華SHA-C恒溫振蕩器，KQ-250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

試劑：(-)-Δ9-四氫大麻酚、1R-2S-(-)-鹽酸麻黃堿、2-羥基乙基氟西泮、6-乙酰嗎啡、7-氨基氯硝西泮、7-氨基氟硝西泮、7-氨基硝西泮、α-羥基阿普唑侖、α-羥基咪達唑侖、α-羥基三唑侖、阿普唑侖、苯丙胺、苯甲酰愛康寧、溴安定、氯硝西泮、可卡因、可待因、脫烴基氟胺安定、地西泮、2-亞乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷、艾司唑侖、氟硝西泮、氟西泮、海洛因、勞拉西泮、3, 4-亞甲基二氧基苯丙胺、3, 4-亞甲基二氧基乙基苯丙胺、3, 4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺、美沙酮、甲基苯丙胺、咪達唑侖、嗎啡、硝甲西泮、硝西泮、去甲基地西泮、奧沙西泮、替馬西泮、三唑侖、唑吡坦、佐匹克隆標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL)均購買自美國Cerilliant標(biāo)準(zhǔn)品公司；乙腈、甲醇和正己烷為色譜級，購自德國Merck公司; 乙酸銨、甲酸為質(zhì)譜級試劑，購買自百靈威試劑公司. 試驗用水均來自Milli-Q純水系統(tǒng)，購買自法國Millipore公司.

標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1.0 μg/mL): 分別準(zhǔn)確量取適量40種精神藥物標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中, 用少量甲醇溶解后, 并用甲醇定容至刻度，逐級稀釋配置成 1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液.

吸毒人員樣本來源于深圳寶安戒毒所，本項目獲得由深圳市生物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)的審查批件(深圳倫審[2018]第(001)號)，使用人體生物樣本開展研究. 本文涉及五位受試者提供的毛發(fā)樣本，編號為SZNTMF0001-0005.

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGII 5 μm)，柱溫：30 ℃， 流速：0.2 μL/min;以含有20 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液的純化水為流動相A, 以色譜純乙腈為流動相B, 按照表1進行梯度洗脫.

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離-正離子模式，檢測方式為動態(tài)多反應(yīng)模式檢測(DMRM)或多反應(yīng)模式(MRM)檢測；參數(shù)設(shè)置：噴嘴電壓：500 V；毛細管電壓：3 500 V；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：5 L/min；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11 L/min；經(jīng)過對毛細管出口去族電壓(DP)、碰撞池能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，最終確定各精神藥物的動態(tài)多反應(yīng)模式檢測參數(shù)如表2所列.

表2 40種精神藥物的動態(tài)多反應(yīng)模式檢測參數(shù)Table 2 Optimized MRM parameters for 40 drugs

續(xù)表2

續(xù)表2

*：定量離子

1.2.3 樣品前處理方法

使用去離子水對毛發(fā)樣本進行粗洗滌，再使用丙酮對經(jīng)過粗洗滌的毛發(fā)樣本進行精洗滌，毛發(fā)晾干后使用冷凍研磨機磨碎. 將20 mg磨碎后的毛發(fā)樣本加至1 mL甲醇中70 ℃超聲提取2 h，在2 000～2 800 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，吸取上清液在70 ℃氮氣揮干，再加入100L甲醇復(fù)溶，上機檢測.

空白毛發(fā)樣本經(jīng)過前處理后，使用上述色譜和質(zhì)譜條件進行檢測，以各種精神藥物均為未檢出進行空白確認(rèn)，用于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及方法精密度和回收率試驗. 具體步驟為：將20 mg空白毛發(fā)樣本按照上述步驟洗滌，晾干后，剪碎，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線配置要求和空白加標(biāo)試驗要求添加相應(yīng)含量的精神藥物標(biāo)準(zhǔn)品，并按照上述步驟超聲提取，揮干，復(fù)溶，上機檢測.

1.2.4 方法學(xué)驗證

分別對線性范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度和回收率進行了考察，同時以3個標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度水平(低：10 ng/g，中：50 ng/g，高：200 ng/g)用于準(zhǔn)確度和回收率試驗.

線性范圍分別使用5個校準(zhǔn)點質(zhì)量濃度(9、40、90、450、770 ng/g)進行曲線擬合，考察相關(guān)系數(shù). 靈敏度通過方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)進行評估，制備了一系列遞減濃度的添加毛發(fā)樣本，經(jīng)過方法前處理后上機測定其信噪比，以確定方法檢出限和方法定量限. LOD被確定為信噪比(S/N)接近于3的濃度，LOQ被確定為信噪比(S/N)接近于10的濃度. 準(zhǔn)確度是通過分別得到低、中、高濃度的6次平行測定的結(jié)果，并計算其RSD進行評估. 回收率試驗是通過考察加標(biāo)毛發(fā)樣本的低、中、高濃度的檢測濃度與實際添加濃度的百分比所得到.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

C18反向柱是廣泛使用的分離色譜柱，目標(biāo)方法涉及的毒藥品種類繁多，為了保持方法的適用性，我們選擇了Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGII 5 μm). 該柱被廣泛應(yīng)用在食品、化妝品和藥品的有關(guān)成分檢測中. 為了保證檢測的靈密度，必須使用梯度洗脫的方法將各個待測物質(zhì)盡量分開，同時考慮檢測效率，將檢測時間控制在15 min內(nèi). 通過方法優(yōu)化，我們最終選擇了1.2.1中所述方法，得到的40種毒藥物的DMRM色譜圖如圖1所示.

圖1 40種毒藥物的DMRM色譜圖Fig. 1 DMRM spectrum of 40 drugs

2.2 樣品前處理優(yōu)化

樣品前處理包括毛發(fā)樣品的清洗處理和毛發(fā)樣本的提取處理[3]. 清洗的目的是除去毛發(fā)表面的污染物質(zhì)，防止其對檢測結(jié)果的干擾，目前文獻采取的主要方法為水洗與丙酮洗滌相結(jié)合的方法. 毛發(fā)樣本提取處理方法較多，根據(jù)分析目標(biāo)物的性質(zhì)可采用無機酸溶液提取方法，例如1%的磷酸溶液、鹽酸溶液提取，無機堿溶液提取(例如5%氫氧化鈉溶液消解提取),有機溶劑提取(例如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等溶劑提取),混合溶劑提取(例如將無機酸溶液和有機溶劑按照比例混合提取). 以上方法的局限性在于采用的浸泡提取方法所需時間長(18～24 h). 我們發(fā)現(xiàn)使用甲醇為溶劑超聲提取可以在短時間內(nèi)完成提取，回收率滿足要求. 通過試驗考察了超聲提取時間和提取溫度參數(shù)的影響，最終優(yōu)化的參數(shù)見1.2.3.

2.3 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

線性范圍的考察是通過選取5個校準(zhǔn)點質(zhì)量濃度(分別為9、40、90、450、770 ng/g)，每個校準(zhǔn)點平行測定6次取平均值進行曲線擬合，并得到相關(guān)系數(shù). 靈敏度通過方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)進行評估. 具體方法為將添加了一系列遞減濃度的精神藥物標(biāo)準(zhǔn)品的毛發(fā)樣本經(jīng)過前處理后上機檢測，使用信噪比(S/N)接近3時的濃度確定為方法檢出限(LOD)，使用信噪比(S/N)接近10時的濃度確定為方法定量限(LOQ)，試驗確定相應(yīng)濃度后平行測定6次取平均值. 結(jié)果顯示該方法對于40種常見精神藥物的回收率為77.3%～94.3%，在線性范圍(9～770 ng/g)內(nèi)相關(guān)系數(shù)大于0.942， 方法檢出限為0.01～0.8 ng/g，所得數(shù)據(jù)如表3所列.

2.4 方法精密度和回收率

回收率是分別考察3個加標(biāo)毛發(fā)樣本(質(zhì)量濃度為10、50、200 ng/g)的檢測(n=6)與實際質(zhì)量濃度的百分比, 準(zhǔn)確度通過分別計算以上低、中、高濃度的6次測定結(jié)果的RSD進行評估，結(jié)果顯示各個待檢目標(biāo)化合物在低、中、高濃度的回收率均高于75%，RSD均在5%以內(nèi)，具體數(shù)據(jù)如表4所列.

2.5 案例應(yīng)用

通過以上建立的方法，對吸毒人員的毛發(fā)樣品(SZNTMF0001-0005)進行檢測， 以確定其可能吸食毒品的種類.

2.5.1 案例1(SZNTMF0001)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機檢測，檢出嗎啡12 ng/g、6-單乙酰嗎啡8 ng/g、可待因10 ng/g、甲基苯丙胺46 ng/g、苯丙胺10 ng/g，DMRM色譜圖如圖2所示.

表3 方法的線性范圍、方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)Table 3 Linearity, limit of detection and limit of quantification

表4 方法精密度和回收率Table 4 Precision and recovery of method

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

圖2 案例1 DMRM圖譜Fig. 2 DMRM spectra of case 1

2.5.2 案例2(SZNTMF0002)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機檢測，檢出甲基苯丙胺49 ng/g、苯丙胺10 ng/g，DMRM色譜圖如圖3所示.

2.5.3 案例3(SZNTMF0003)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機檢測，檢出嗎啡64 ng/g、6-單乙酰嗎啡14 ng/g、可待因13 ng/g，DMRM色譜圖如圖4所示.

圖3 案例2 DMRM圖譜Fig. 3 DMRM spectra of case 2

圖4 案例3 DMRM圖譜Fig. 4 DMRM spectra of case 3

2.5.4 案例4(SZNTMF0004)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機檢測，檢出嗎啡51 ng/g、6-單乙酰嗎啡16 ng/g、可待因15 ng/g、海洛因11 ng/g，DMRM色譜圖如圖5所示.

圖5 案例4 DMRM圖譜Fig. 5 DMRM spectra of case 4

2.5.5 案例5(SZNTMF0005)

將20 mg毛發(fā)樣本按照前處理方法處理，提取液上機檢測，檢出嗎啡84 ng/g、6-單乙酰嗎啡5.6 ng/g、可待因19 ng/g、海洛因13 ng/g、美沙酮16.8 ng/g，DMRM色譜圖如圖6所示.

圖6 案例5 DMRM圖譜Fig. 6 DMRM spectra of case 5

3 結(jié)論

本文建立了一種使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對毛發(fā)中40種常見精神藥物進行定性和定量的檢測方法. 本方法檢測時間短，靈敏度高，可用于人體毛發(fā)樣本中精神藥物的快速檢測, 為公安民警辦案提供了有力的技術(shù)支持.