馬曄 陳躍宇

摘 要：目的 觀察不同碘攝入量對(duì)大鼠促甲狀腺激素受體（TSHR）mRNA、鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（NIS）mRNA以及血清過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb）表達(dá)水平的影響。方法 SD大鼠30只，隨機(jī)分成低碘組（LI）、適碘組（NI）和高碘組（HI），每組10只。于實(shí)驗(yàn)第8、16周分批處死。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測(cè)定TSHR mRNA及NIS mRNA表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫分析法觀察血清TPOAb濃度。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)8周，低碘組和高碘組TSHR mRNA及NIS mRNA表達(dá)水平均低于適碘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且血清TPOAb濃度高于適碘組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)16周，高碘組和低碘組的TSHR mRNA和NISmRNA表達(dá)水平均明顯低于適碘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；血清TPOAb濃度高于適碘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 包括碘過(guò)量和碘缺乏在內(nèi)的長(zhǎng)期碘營(yíng)養(yǎng)障礙均可降低NIS及TSHR的正常表達(dá)，同時(shí)提高甲狀腺自身抗體的濃度，影響甲狀腺攝碘功能。

關(guān)鍵詞：碘；甲狀腺；鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體；促甲狀腺激素受體；甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體

中圖分類號(hào)：R581 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.023

文章編號(hào)：1006-1959（2018）23-0083-03

Abstract：Objective To investigate the effects of different iodine intake on the expression of （TSHR） mRNA， sodium iodide transporter （NIS） mRNA and peroxidase antibody （TPOAb） in rat thyroid stimulating hormone receptor.Methods 30 SD rats were randomly divided into two groups： low iodine group （LI）， normal iodine group （NI） and high iodine group （HI），） 10 rats in each group. The rats were executed in batches at the 8th ，16th week.The expression levels of TSHR mRNA and NIS mRNA were measured by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction. The concentration of serum TPOAb was observed by enzyme linked immunosorbent assay.Results At the 8th week of the experiment， the expression of TSHR mRNA and NIS mRNA in iodine deficiency group and high iodine group were lower than that in normal iodine group，the difference was statistically significant （P<0.05）.The concentration of serum TPOAb was higher than that of iodine group， but there was no significant difference （P>0.05）.At the 16th week of experiment， the expression levels of TSHR mRNA and NISmRNA in high iodine group and low iodine group were significantly lower than those in normal iodine group，the difference was statistically significant （P<0.05）.The concentration of serum TPOAb was higher than that of iodine group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion Chronic iodine nutritional disorder，including iodine excess and iodine deficiency， can decrease the normal expression of NIS and TSHR， increase the concentration of thyroid autoantibodies and affect the iodine uptake function of thyroid.

Key words：Iodine；Thyroid；Sodium iodide transporter；Thyrotropin receptor；Thyroid peroxidase antibody

甲狀腺是人體重要的內(nèi)分泌器官，它通過(guò)攝取碘合成甲狀腺激素來(lái)維持其正常的調(diào)節(jié)功能 。外界碘環(huán)境的變化可通過(guò)影響分布于甲狀腺濾泡細(xì)胞基底膜側(cè)的特異性鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na+/I-symporter，NIS）的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)甲狀腺組織的攝碘功能[1，2]。與此同時(shí)，同樣分布于甲狀腺濾泡細(xì)胞基底膜側(cè)的促甲狀腺激素受體（TSHR）可與TSH結(jié)合并激活由c-AMP介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，上調(diào)NIS的表達(dá)并促進(jìn)其向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)其在濾泡細(xì)胞基底膜側(cè)的分布與定位，提高甲狀腺組織攝碘率。過(guò)氧化物酶（TPO）是甲狀腺微粒體抗原的重要組成部分之一 ，與自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb）是甲狀腺抑制性抗體，其生成過(guò)多會(huì)造成甲狀腺素的產(chǎn)生減少，影響甲狀腺的攝碘功能[3，4]。本實(shí)驗(yàn)利用構(gòu)建不同碘營(yíng)養(yǎng)水平的大鼠動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)觀察碘對(duì)大鼠甲狀腺TSHR mRNA及NIS mRNA表達(dá)水平的影響，并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期碘營(yíng)養(yǎng)障礙對(duì)甲狀腺自身抗體的影響。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象 SD大鼠30只，體重120～160 g，平均體重為（138.54±8.32）g，清潔級(jí)，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組：①低碘組；②適碘組；③高碘組，每組10只。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1試劑和儀器 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒、SYBR Green（綠色）熒光染料試劑盒（日本TAKARA公司），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司），兔抗大鼠NIS多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），熒光定量PCR儀（德國(guó)EPPENDOFF公司）。TPOAb采用免疫化學(xué)發(fā)光分析法， Axsym全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑（美國(guó)雅培公司）。

1.2.2動(dòng)物處理 低碘組動(dòng)物飼以低碘飼料（平均碘含量為30 μg/kg），其余兩組飼以正常飼料（平均含碘量300 μg/kg）；低碘組飲用去離子水，適碘組飲用自來(lái)水，高碘組飲用含碘化鈉的自來(lái)水（平均碘含量為3000 μg/kg）。各組動(dòng)物分別于實(shí)驗(yàn)8、16周處死，每組每次處死5只，甲狀腺組織離體后立即置于液氮中保存。

1.2.3實(shí)時(shí)定量熒光PCR測(cè)定（real time polymerase chain reaction，RT-PCR）甲狀腺組織TSHR mRNA及 NISmRNA的表達(dá) RNA提取按trizol試劑盒說(shuō)明方法提取組織總RNA，按RT試劑盒說(shuō)明方法逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，引物序列及擴(kuò)增堿基對(duì)數(shù)目見表1；體系為20 μl，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s，54 ℃退火15s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。每管樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.4 免疫分析法測(cè)定大鼠血清過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb） 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天大鼠麻醉成功后，經(jīng)頸靜脈采血2 ml，1 h內(nèi)分離血清，置于-20 ℃保存，測(cè)定前置室溫自然融化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步多重比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠甲狀腺TSHR mRNA的表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)第8周，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組存在組間差異（F=11.77，P=0.008），低碘組和高碘組TSHR mRNA表達(dá)均低于適碘組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)第16周，低碘組與高碘組的TSHR mRNA表達(dá)水平均低于適碘組（P<0.01），實(shí)驗(yàn)第16周，低碘組與高碘組TSHR mRNA表達(dá)水平均低于實(shí)驗(yàn)第8周（P<0.05），見表2。

2.2大鼠甲狀腺NIS mRNA的表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)第8周，低碘組NIS mRNA表達(dá)低于適碘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高碘組低于適碘組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)16周，低碘組與高碘組的NIS mRNA表達(dá)水平均低于適碘組（P<0.01），低碘組低于高碘組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第16周，低碘組與高碘組NIS mRNA表達(dá)水平均低于實(shí)驗(yàn)第8周（P<0.05），見表3。

2.3大鼠血清中TPOAb水平 實(shí)驗(yàn)第8周，低碘組血清TPOAb水平高于適碘組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），高碘組血清TPOAb水平高于適碘組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第16周，低碘組和高碘組的血清TPOAb水平高于適碘組（P<0.05），且均高于實(shí)驗(yàn)第8周水平，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3 討論

甲狀腺激素的合成依賴于分布于功能靶位的NIS在Na+/K+-ATP酶供能的情況下將活性碘從細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至甲狀腺細(xì)胞中[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6，7]，去除TSH的FRTL-5細(xì)胞，其質(zhì)膜上的NIS表達(dá)明顯下降。由此可見，TSH與碘分子同為NIS表達(dá)的過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)劑，生理情況下，TSH與位于甲狀腺濾泡細(xì)胞基底膜側(cè)的TSHR結(jié)合，通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶（AC）介導(dǎo)c-AMP信號(hào)通路等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，上調(diào)NIS的表達(dá)并促進(jìn)其定位于功能靶位。一旦TSHR發(fā)生異常，甲狀腺的碘化及激素合成過(guò)程將會(huì)受到影響。另一方面碘攝入量可影響甲狀腺激素的合成，高碘可下調(diào)NIS的表達(dá)，這是甲狀腺對(duì)高碘的自調(diào)節(jié)機(jī)制，其分子基礎(chǔ)是過(guò)氧化物酶（TPO）和NIS。TPO是甲狀腺素合成的關(guān)鍵酶，其活性的高低直接影響甲狀腺攝碘功能。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道[8，9]，長(zhǎng)期高碘可降低大鼠甲狀腺TPO活性。與之對(duì)應(yīng)的TPOAb是主要的甲狀腺組織自身抗體，其增高與甲狀腺組織的損傷密切相關(guān)，甚至可能誘發(fā)甲狀腺癌[10，11]。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，短期的碘營(yíng)養(yǎng)障礙可啟動(dòng)甲狀腺自身保護(hù)機(jī)制，通過(guò)反饋性地引起垂體TSH合成和分泌增加，使得TSH與TSHR結(jié)合調(diào)控NIS蛋白表達(dá)在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，從而保證甲狀腺的正常攝碘。隨著暴露于碘營(yíng)養(yǎng)障礙環(huán)境中的時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，甲狀腺無(wú)法實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)，NIS及TSHR mRNA的水平進(jìn)行性下降，從而影響甲狀腺細(xì)胞的攝碘功能。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨著碘營(yíng)養(yǎng)障礙時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清中TPOAb濃度不斷增高，這可能是因?yàn)門PO的活性降低后，甲狀腺濾泡細(xì)胞對(duì)TPO的利用率下降，從而導(dǎo)致血清中抗體的增高，從而增加了甲狀腺細(xì)胞被破壞的風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)合本課題組建立的長(zhǎng)期碘營(yíng)養(yǎng)障礙動(dòng)物模型可以看出，長(zhǎng)期處于碘缺乏或碘過(guò)量環(huán)境中，甲狀腺濾泡細(xì)胞的攝碘功能將受到一定的影響，甲狀腺組織被自身抗體破壞的風(fēng)險(xiǎn)不斷增加，這也可能是甲狀腺相關(guān)疾病發(fā)生和發(fā)展的重要誘因之一。因此，如何正確補(bǔ)碘、控制碘攝入量將是全社會(huì)需要重視的問題也是未來(lái)科學(xué)研究的重點(diǎn)。

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收稿日期：2018-9-5；修回日期：2018-9-21

編輯/雷華