曾浩濤
[摘要]目的 研究金果欖中古倫賓在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)。方法 從金果欖的干燥塊根中制備提取古倫賓,建立超高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)古倫賓方法。色譜條件,色譜柱:Acquity UPLCR BEN C18(2.1×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:0.3%磷酸溶液-乙腈(65:35);流速:1 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm;柱溫:35℃。考察該方法的專(zhuān)屬性、線性、定量限、提取回收率、精密度和穩(wěn)定性;測(cè)定不同濃度古倫賓對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積,制作古倫賓濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線;對(duì)家兔進(jìn)行古倫賓灌胃注藥(50 mg/kg),于給藥后0、15、30、60、120、180、240、360、480、1400 min后進(jìn)行耳緣靜脈采血,測(cè)量古倫賓濃度,繪制血藥濃度-時(shí)間曲線,運(yùn)用WinNonlin 3.3軟件計(jì)算相應(yīng)古倫賓在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果 色譜圖峰形顯示,古倫賓保留時(shí)間在16 min,峰形正態(tài)分布,與其他峰分離良好,無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾。古倫賓濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=502967X+0.1501,相關(guān)系數(shù)r=0.995,線性范圍為0.00122~2.50000 nmol/L,最低定量限為1.22×10-3 nmol/L。質(zhì)量濃度為9.77、156.25、1250.00 nmol/L的古倫賓血漿溶液提取回收率均在80.0%以上,平均回收率為84.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=3.1%。156.25 nmol/L的古倫賓血漿溶液的日間RSD=3.5%。第1天日內(nèi)RSD=1.7%,第2天日內(nèi)RSD=4.6%。室溫保存24 h,反復(fù)凍融3次,以及-20℃冷凍保存14 d時(shí)的回收率均為90.0%~110.0%。藥動(dòng)學(xué)參數(shù):達(dá)峰時(shí)間(Tmax)=68.9 min、峰濃度(Cmax)=0.0671 nmol/L、末端消除半衰期(T1/2)=438.67 min、藥時(shí)曲線下面積(AUC)=81.49、末端消除速率(Ke)=0.0017、清除率(CL)=20132.72、生物利用度(F)=14.08%。結(jié)論 UPLC法測(cè)定古倫賓濃度,其專(zhuān)屬性、提取回收率、穩(wěn)定性均符合要求,適用于對(duì)金果欖中古倫賓在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)研究。
[關(guān)鍵詞]古倫賓;金果欖;藥動(dòng)學(xué)研究;超高效液相色譜
[中圖分類(lèi)號(hào)] R977.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721(2018)9(b)-0013-05
[Abstract] Objective To study the pharmacokinetics of columbin from Radix Tinosporae in rabbits in vivo. Methods The columbin was extracted from the dried root of Radix Tinosporae, and the UPLC method for the determination of columbin was established. Chromatographic conditions, column: Acquity UPLCR BEN C18 (2.1×100 mm, 1.7 μm); mobile phase: 0.3% phosphoric acid solution-acetonitrile (65:35); flow rate: 1 ml/min; detection wavelength: 225 nm; temperature: 35°C. The specificity, linearity, quantitative limits, extraction recovery, precision and stability of the method were investigated. The peak area of the standard solution of different concentrations of culumbin was determined, and used to make the standard curve of the concentration of culumbin. The culumbin (50 mg/kg) was gavaged to rabbits, and limbic vein blood collection was conducted at 0, 15, 30, 60, 120, 180, 240, 360, 480 and 1400 min after administration. The blood concentration-time curve was drawn, and the corresponding pharmacokinetic parameters of culumbin in rabbits were calculated by using WinNonlin 3.3 software. Results Peak shape of the chromatogram showed that the retention time of culumbin was 16 min, with normal peak shape distribution. It was well separated from other peaks, and there was no endogenous material interference. The standard curve equation of culumbin concentration was Y=502967X+0.1501, the correlation coefficient r=0.995, the linear range was 0.00122-2.50000 nmol/L, and the minimum quantitative limit was 1.22×10-3 nmol/L. The recovery rate of the plasma solution of culumbin at the mass concentration of 9.77, 156.25 and 1250.00 nmol/L was over 80.0%, the average recovery rate was 84.2%, and the relative standard deviation (RSD)=3.1%. The RSD between two days of the 156.25 nmol/L culumbin plasma solution was 3.5%, the first day RSD was 1.7%, the second day RSD was 4.6%. Preserved 24 h at room temperature, repeated freezing, thawing 3 times, and -20℃ cryopreservation 14 d average recovery was 90.0%-110.0%. Pharmacokinetic parameters: Tmax=68.9 min, peak concentration (Cmax) =0.0671 nmol/L, terminal elimination half-life (T1/2)=438.67 min, medication in the area under the curve (AUC)=81.49, end eliminate rate (Ke)=0.0017, clearance (CL)=20132.72, bioavailability (F)=14.08%. Conclusion The UPLC method was used to determine the concentration of columbin, and its specificity, extraction recovery and stability all meet the requirements, which is suitable for the systematic study of the pharmacokinetics of columbin in rabbits.
[Key words] Columbin; Radix Tinosporae; Pharmacokinetic study; Ultra high performance liquid chromatography
金果欖(Radix Tinosporae),別名青牛膽、山慈菇、地苦膽、金獅藤,是《中國(guó)藥典》收錄的草藥,來(lái)源為防己科酸模屬[1]。臨床上具有清熱解毒的功能,常用于治療咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾以及脘腹疼痛等[2]。古籍《本草再新》認(rèn)為金果欖:“滋陰降火,止渴生津”?!端幮钥肌分刑岬剑骸敖舛尽Q屎肀约?,口爛宜服。疽癰發(fā)背,蛇蝎蟲(chóng)傷,磨涂。治目痛,耳脹,熱嗽,嵐瘴,吐衄,一切外癥”。金果欖與黨參、丹參、當(dāng)歸和北沙參共同制成復(fù)方黨參片,是活血化瘀、益氣寧心的有效藥物[3]。另外,金果欖在心肌缺血引起的心絞痛或胸悶等方面同樣具有廣泛的應(yīng)用[4]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示,古倫賓是金果欖中的有效成分之一[5]。對(duì)古倫賓的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究,有助于從科學(xué)的角度全面的控制相關(guān)制劑的質(zhì)量[6],本研究利用UPLC檢測(cè)方法對(duì)金果欖中古倫賓在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)道如下。
1儀器與試藥
1.1儀器
Acquity UPLC超高效液相色譜儀(Waters,美國(guó));梅特勒XS105DU分析天平(梅特勒,瑞士);DZKW-S-4恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療器械有限公司)。
1.2藥品與試劑
古倫賓由本課題組從金果欖的干燥塊根中制備提取,結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1,結(jié)構(gòu)式C20H22O6,相對(duì)分子質(zhì)量358.39??诜鞈覄┵?gòu)自O(shè)ral-plus(美國(guó)Paddock實(shí)驗(yàn)室);古倫賓對(duì)照品(產(chǎn)品批號(hào):111837-201703)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇(分析純)、磷酸(分析純)及乙腈(色譜純)購(gòu)于德國(guó)默克;超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。
1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
體質(zhì)量2.5~3.2 kg的6只雄性家兔,均由學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為GXXK(桂)2013-19。
2研究方法
2.1色譜條件
色譜柱:Acquity UPLCRBEN C18(2.1×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:0.3%磷酸溶液-乙腈(65:35);流速:1 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm;柱溫:35℃。
2.2溶液配制
2.2.1對(duì)照品溶液的配制 ①2 mmol/L古倫賓對(duì)照品儲(chǔ)備液配制:分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取古倫賓對(duì)照品0.0358 g溶解于少量空白血漿中,搖勻,利用空白血漿定容至5 ml,保存于-20℃冰箱中。②將儲(chǔ)備液稀釋制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:將古倫賓對(duì)照品儲(chǔ)備液用空白血漿稀釋成2.50000、1.25000、0.62500、0.31250、0.15625、0.07813、0.03906、0.01953、0.00977、0.00488、0.00244、0.00122 nmol/L系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液。③質(zhì)量控制溶液配制:將古倫賓對(duì)照品儲(chǔ)備液用空白血漿稀釋成濃度為9.77、156.25、1250 nmol/L的溶液,每種溶液平行配制3份,保存于-20℃冰箱中。
2.2.2血漿預(yù)處理方法 專(zhuān)用負(fù)壓玻璃管,標(biāo)注采血時(shí)間及試驗(yàn)號(hào)。將血液樣本以15 000 r/min離心15 min,將血清血漿分離。移取100 μl血漿至新的離心管中。加入高氯酸(4.0 μg/ml)100 μl沉淀血漿中蛋白質(zhì)及大分子脂類(lèi),以15 000 r/min離心10 min,取上清液10 μl進(jìn)行測(cè)定。
2.3給藥方案與樣品采集
以50 mg/kg的灌藥劑量對(duì)健康家兔進(jìn)行灌胃給藥,給藥后于0、15、30、60、120、180、240、360、480、1400 min后進(jìn)行耳緣靜脈采血取血。每次取血量約1 ml,進(jìn)行預(yù)處理后,平行進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)。
2.4數(shù)據(jù)分析與處理
制作血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算血藥濃度,獲取濃度數(shù)據(jù)后運(yùn)用WinNonlin 3.3軟件計(jì)算相應(yīng)古倫賓在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
3結(jié)果
3.1方法專(zhuān)屬性考察
實(shí)驗(yàn)前取家兔血漿少量,并按照步驟“2.2.2項(xiàng)”下方法,進(jìn)行預(yù)處理后作為空白血漿,分別利用“2.1項(xiàng)”色譜條件對(duì)空白血漿、古倫賓標(biāo)準(zhǔn)品、空白血漿+古倫賓標(biāo)準(zhǔn)品及給藥960 min后的血漿樣品(含古倫賓)進(jìn)行定性分析。色譜圖峰形顯示,古倫賓保留時(shí)間在16 min,峰形正態(tài)分布,與其他峰分離良好,無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾,提示該方法專(zhuān)屬性良好(圖2)。
3.2線性和定量限考察
測(cè)定不同濃度古倫賓對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積平行3次試驗(yàn)(表1),以峰面積(Y)作為縱坐標(biāo),以濃度(X)作為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸運(yùn)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。軟件處理得線性回歸方程為Y=502967X+0.1501,相關(guān)系數(shù)r=0.995。以信噪比(S/N)≥10計(jì)算定量限,最低定量限為1.22×10-3 nmol/L。
3.3提取回收率考察
取古倫賓對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用空白血漿稀釋制成質(zhì)量濃度為9.77、156.25、1250.00 nmol/L的古倫賓血漿溶液,按照步驟“2.2.2項(xiàng)”下方法進(jìn)行預(yù)處理并進(jìn)行測(cè)定,利用線性回歸方程計(jì)算檢測(cè)古倫賓濃度,回收率(%)=檢測(cè)濃度/理論濃度×100%,結(jié)果提示,質(zhì)量濃度為9.77、156.25、1250.00 nmol/L的古倫賓血漿溶液提取回收率均在80.0%以上,RSD<10%,提示該方法準(zhǔn)確度符合要求(表2)。
3.4精密度考察
取古倫賓對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用空白血漿稀釋制成濃度為156.25 nmol/L的溶液,平行配制6份樣品進(jìn)行分析,計(jì)算日內(nèi)、日間精密度,RSD值在10%以下,提示精密度良好,符合檢測(cè)要求(表3)。
3.5穩(wěn)定性考察
取質(zhì)量濃度為9.77、156.25、1250 nmol/L的古倫賓血漿溶液,分別考察樣本在處理后室溫保存24 h,反復(fù)凍融3次,以及-20℃冷凍保存14 d的穩(wěn)定性,結(jié)果提示,古倫賓在上述條件下回收率均為90.0%~110.0%,基本穩(wěn)定,該方法符合目前生物樣品分析方法有關(guān)要求,可用于藥動(dòng)學(xué)研究(表4)。
3.6藥動(dòng)學(xué)研究
按“2.3項(xiàng)”下血液樣品采集方法,測(cè)定給藥后不同時(shí)間的血藥濃度(表5),采用WinNonlin 3.3軟件計(jì)算和處理藥動(dòng)學(xué)參數(shù),繪制血藥濃度-時(shí)間曲線,主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)包括:達(dá)峰時(shí)間(Tmax)=68.9 min、峰濃度(Cmax)=0.0671 nmol/L、末端消除半衰期(T1/2)=438.67 min、藥時(shí)曲線下面積(AUC)=81.49、末端消除速率(Ke)=0.0017、清除率(CL)=20132.72、生物利用度(F)=14.08 %(圖3)。
4討論
研究表明,金果欖中主要活性成分為古倫賓[7]。2010年版《中國(guó)藥典》中,古倫賓已取代原來(lái)的鹽酸巴馬汀作為含量測(cè)定指標(biāo)成分,用于評(píng)價(jià)金果欖藥材質(zhì)量[8]。有研究測(cè)定了不同產(chǎn)地金果欖藥材中古倫賓的不同含量,借以確定判斷金果欖質(zhì)量?jī)?yōu)劣的新標(biāo)準(zhǔn),高效液相色譜(HPLC)檢驗(yàn)結(jié)果顯示,重慶、廣西崇左、陜西漢中和四川萬(wàn)源等地所產(chǎn)者含量相對(duì)較高,這些產(chǎn)地所產(chǎn)金果欖質(zhì)量更優(yōu)[9-10]。分析發(fā)現(xiàn),對(duì)金果欖中古倫賓的含量測(cè)定方法的開(kāi)發(fā),是研究熱點(diǎn)之一[11]。例如,崔小敏等[12]研究發(fā)現(xiàn)膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法可以準(zhǔn)確測(cè)定金果欖中古倫賓的含量,采用未涂層熔融石英毛細(xì)管柱方法準(zhǔn)確、可靠、環(huán)保,適用于金果欖中古倫賓和蝙蝠葛任堿含量的同時(shí)測(cè)定。張進(jìn)芳等[13]采用HPLC測(cè)定復(fù)方黨參片中古倫賓的含量,同樣取得良好效果。
藥動(dòng)學(xué)研究的意義在于定量研究藥物在機(jī)體內(nèi)吸收、分布、排泄和代謝規(guī)律,為臨床藥物的用量用法進(jìn)行指導(dǎo)[14-15]。家兔是進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究時(shí)較為常見(jiàn)的一種試驗(yàn)動(dòng)物,包括氨茶堿[16]、布渣葉總黃酮[17]、金銀花超微飲片[18]以及克癌素結(jié)腸包衣滴丸[19]等。古倫賓經(jīng)口服給藥后其藥-時(shí)曲線如圖3所示。采用非房室模型方法估算,經(jīng)WinNonlin 3.3軟件擬合數(shù)據(jù)后可獲得古倫賓的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),古倫賓通過(guò)口服的吸收是很快速的。本研究結(jié)果提示,古倫賓通過(guò)口服可以到達(dá)快速吸收的效果。但口服古倫賓生物利用度僅為14.08%,利用度較低,可能是肝臟首過(guò)效應(yīng)導(dǎo)致古倫賓較低的生物利用度[20]。
本研究建立了一種快速、靈敏和專(zhuān)屬性強(qiáng)的UPLC法測(cè)定家兔中的古倫賓濃度及其吸收藥代動(dòng)力學(xué)特性。其專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠,血液中的最低定量限為1.22×10-3 nmol/L。該方法精密度、提取回收率、穩(wěn)定性均符合方法學(xué)考察要求。
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