方可，李婷，朱艷冰,2,3，倪輝,2,3，黃高凌,2,3

（1.集美大學(xué)食品與生物學(xué)院，福建廈門 361021）（2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361021）

（3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

香氣是評(píng)價(jià)茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要因素。茶葉中香氣的實(shí)質(zhì)是不同芳香成分以不同濃度組合的綜合表現(xiàn)，研究茶葉產(chǎn)品香氣特征及化學(xué)組成不僅可以豐富茶葉生物化學(xué)理論知識(shí)，而且對(duì)改善和提高茶葉香氣品質(zhì)也具有重要意義[1]。茶葉根據(jù)加工方式不同可分為白茶、黃茶、綠茶、烏龍茶、紅茶和黑茶[2]，其中烏龍茶屬于半發(fā)酵茶，既有綠茶的清香和花香，又有紅茶的醇厚滋味，受到廣大消費(fèi)者喜愛[3]。隨著人們生活節(jié)奏的加快，以及產(chǎn)業(yè)分工的精細(xì)化，速溶茶粉以其方便攜帶、容易加工等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為茶葉食品的重要中間體[4]，但是由于速溶茶粉在加工過程中經(jīng)過高溫浸提、真空濃縮、噴霧干燥等加工工藝，導(dǎo)致茶葉原有風(fēng)味成分大量損失，如朱旗等人[5]研究發(fā)現(xiàn)，噴霧干燥后的速溶茶粉香氣與茶葉香氣相差較大。茶中香氣成分主要來源于類胡蘿卜素降解、油脂氧化、糖苷類前體水解和美拉德反應(yīng)[6]。相關(guān)研究表明，許多香氣成分以糖苷類前體的形式存在于茶葉中[7]，并且茶本身存在一些可以水解前體成分釋放香氣成分的關(guān)鍵酶類，例如β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和β-櫻草糖苷酶等[8]。在茶葉及速溶茶粉加工過程中，雖然高溫會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源糖苷酶失活，但是殘留的糖苷類前體仍然可以在外源糖苷酶作用下釋放出香氣成分。

改善速溶茶粉香氣的眾多方法中，酶技術(shù)是較為有效的方法[9]，因?yàn)槊缚商禺愋缘刈饔糜谙銡馇绑w釋放出游離的香氣成分[10]，且不影響其他活性及風(fēng)味成分，因此可在速溶茶粉后續(xù)加工產(chǎn)品生產(chǎn)的配料過程中進(jìn)行酶反應(yīng)而改良風(fēng)味。有學(xué)者利用外源β-葡萄糖苷酶處理綠茶湯后，順式-3-己烯醇、水楊酸甲酯和芳香族醇含量顯著增加[11]。β-葡萄糖苷酶處理綠茶、烏龍茶和紅茶后香氣精油總量分別增加了 20.69%、10.30%和6.79%[12]。雖然已有研究報(bào)道β-葡萄糖苷酶對(duì)茶湯和茶飲料的影響，但由于不同茶葉產(chǎn)品中殘留的香氣前體不同，目前尚不明確各類速溶茶粉中香氣前體的種類及含量，且尚未研究β-葡萄糖苷酶對(duì)速溶茶粉產(chǎn)品香氣的釋放作用。

針對(duì)以上研究現(xiàn)狀，本文用β-葡萄糖苷酶對(duì)速溶烏龍茶粉水溶液進(jìn)行處理，綜合運(yùn)用GC-MS、感官品評(píng)和OAVs分析評(píng)價(jià)酶處理前后的香氣變化，闡明β-葡萄糖苷酶對(duì)速溶烏龍茶粉水溶液香氣的改良效果，為提高速溶茶粉后續(xù)加工產(chǎn)品的風(fēng)味提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

噴干型速溶烏龍茶粉，由福建大閩食品有限公司提供。

1.2 主要試劑

β-葡萄糖苷酶購于上海源葉公司；環(huán)己酮、正構(gòu)烷烴（C8-20）、2-甲基呋喃、2-乙基呋喃、N-乙基吡啶、芳樟醇、壬醛、癸醛、反式-β-羅勒烯、α-萜品烯、萜品油烯、γ-萜品烯、壬醛、3,5-二甲基苯酚、2-戊基呋喃購于美國(guó) Sigma公司；香葉醇、苯甲醛、順式-3-己烯醇、水楊酸甲酯、己酸己酯、傘花烴、檸檬烯、反式-β-羅勒烯、己醇、辛醇購于英國(guó)Alfa Aesar公司。

1.3 主要儀器

手動(dòng) SPME進(jìn)樣器，美國(guó) Supelco公司（Bellefonte，PA，USA）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭購于美國(guó)Supelco公司；QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），日本島津公司；Rtx-5MS色譜柱購于美國(guó) Restek公司（Bellefonte，PA，USA）；RO-03A制冰機(jī)購于深圳市日歐制冷設(shè)備有限公司；GZX-DH電熱恒溫干燥箱購于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的制備

速溶烏龍茶粉水溶液樣品：稱取3 g速溶烏龍茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水。

β-葡萄糖苷酶溶液：在60 mL頂空瓶中加入β-葡萄糖苷酶（10 U）和30 mL純水。

β-葡萄糖苷酶處理速溶烏龍茶粉水溶液樣品：稱取3 g速溶烏龍茶粉于60 mL頂空瓶中，加入30 mL純水和β-葡萄糖苷酶（10 U）。

1.4.2 GC-MS分析的操作條件[13]

樣品在40 ℃水浴鍋中平衡1 h后吸附20 min，在進(jìn)樣口處解吸附3 min。按照以下的條件進(jìn)行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱是 Rtx-5MS（60 m×0.32 mm×0.25 μm），用高純氦氣（純度99.999%）作為載氣，柱流量為3 mL/min，不分流進(jìn)樣。升溫程序：選擇程序升溫，進(jìn)樣口溫度為230 ℃；最初溫度為50 ℃并保持5 min，以3 ℃/min升溫至200 ℃，在200 ℃保持1 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為 200 ℃，電離方式為EI，電離能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，掃描方式選擇SCAN模式進(jìn)行定性分析，離子碎片的掃描范圍為35～500 m/z。溶劑延遲時(shí)間為1.5 min。定量分析時(shí)質(zhì)譜掃描方式設(shè)為SIM模式。

1.4.3 揮發(fā)性成分的定性、定量分析

樣品通過GC-MS進(jìn)行分析，將特征離子峰和保留指數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)品、揮發(fā)性成分譜庫（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）以及參考文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)照后定性。其中，保留指數(shù)運(yùn)算借鑒 Kratz和 Vandendoo[14]的方法：RIx=100n+100[t(i)-t(n)]/[t(n+1)-t(n)]進(jìn)行計(jì)算，其中RIx為待測(cè)定成分的保留指數(shù)，t(i)為待測(cè)成分的調(diào)整保留時(shí)間，t(n)表示具有n個(gè)碳原子數(shù)的正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留時(shí)間，t(n+1)表示具有 n+1個(gè)碳原子數(shù)的正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留時(shí)間，平行試驗(yàn)一組三次。對(duì)于2-甲基呋喃和順式-3-己烯醇等21種成分通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，其余16種成分通過內(nèi)標(biāo)環(huán)己酮進(jìn)行定量（SIM模式，內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮，特征碎片為55）。

1.4.4 揮發(fā)性成分的感官評(píng)價(jià)

根據(jù) ISO 8589標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)[13,15]方法為參考對(duì)速溶烏龍茶粉及β-葡萄糖苷酶處理的速溶烏龍茶粉進(jìn)行感官評(píng)價(jià)分析，選取青草香、花香、甜香、果香和焦糖香為作為感官評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

1.4.5 揮發(fā)性成分香氣強(qiáng)度值的計(jì)算

香氣強(qiáng)度值（OAVs）的計(jì)算公式：香氣強(qiáng)度值（OAVs）=嗅感成分濃度/閾值。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析

顯著性分析和主成分分析通過 Excel 2013和SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-葡萄糖苷酶處理速溶烏龍粉的揮發(fā)性成分定性分析

對(duì)速溶烏龍粉及其經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理后的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，得到揮發(fā)性成分的總離子流圖（如圖1），然后依據(jù)相似度檢索、特征離子碎片分析和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比以及參照相關(guān)文獻(xiàn)，共鑒定出37種揮發(fā)性成分（如表1），其中呋喃類4種，醛類5種，醇類9種，酯類4種，烯烴類11種和其它類4種。醇類和烯烴類占總揮發(fā)性成分的54%，為主要組成部分，醛類次之。由此可知，醇類、萜烯類、醛類為主要揮發(fā)性成分。

圖1 速溶烏龍茶粉水溶液、酶處理樣品及β-葡萄糖苷酶溶液揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of the volatiles in instant oolong tea infusion (A), the enzyme treated sample (B) and β-glucosidase solution (C)

表1 速溶烏龍茶粉水溶液及β-葡萄糖苷酶處理后樣品中揮發(fā)性成分的鑒定及標(biāo)準(zhǔn)曲線Table1 Identification and standard curves of volatile compounds in instant oolong tea iufusion and the β-glucosidase treated sample

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注：保留指數(shù)為Rtx-5MS色譜柱結(jié)果，RIxa是本研究測(cè)定值，RIxb為文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值，SCIS為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)曲線來估計(jì)的濃度變化，Std為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照作為鑒定依據(jù)，MS為質(zhì)譜庫（NISTO8，NISTO8s，F(xiàn)FNSC 1.3）搜索結(jié)果作為鑒定依據(jù)，TI代表成分暫時(shí)依靠數(shù)據(jù)庫檢索鑒定，P表示參考文獻(xiàn)，P[n]表示第n篇參考文獻(xiàn)，未標(biāo)明的P均參考此網(wǎng)站：http://www.flavornet.org/flavornet.html,nd為未檢測(cè)到的成分。

2.2 β-葡萄糖苷酶處理速溶烏龍粉的揮發(fā)性成分定量分析

按1.4.3所述方法，根據(jù)各成分峰面積（圖1）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表2所示。

從表2可知，速溶烏龍茶粉水溶液中鑒定出了26種揮發(fā)性成分，包括醛類4種、醇類1種、烯烴類11種、酯類2種、呋喃類4種及其他類化合物4種；β-葡萄糖苷酶處理速溶烏龍茶粉水溶液中鑒定出了 35種揮發(fā)性成分，包括醛類5種、醇類9種、烯烴類9種、酯類4種、呋喃類4種及其他類化合物4種。結(jié)果表明速溶茶粉揮發(fā)性成分以烯烴類為主，而酶處理后以醇類、烯烴類和醛類為主，該結(jié)果與周玲[3]所研究的烏龍茶揮發(fā)性成分以萜烯類、酯類和醇類為主相似。速溶茶粉主要揮發(fā)性成分為癸醛、反-β-羅勒烯、α-法呢烯、2-甲基呋喃和2-乙基呋喃，與之前學(xué)者[19,20]報(bào)道的烏龍茶主要揮發(fā)性成分橙花叔醇、茉莉酮酸甲酯、茉莉內(nèi)酯、吲哚和法呢烯對(duì)比相差較大，其原因可能是速溶茶粉加工過程中發(fā)生氧化、縮合、聚合和基團(tuán)轉(zhuǎn)移等造成速溶茶粉揮發(fā)性成分和原茶葉揮發(fā)性成分的差異[9,21]；與靳巧麗等人[22]所報(bào)道的速溶烏龍茶粉主要揮發(fā)性成分芳樟醇、反式-β-羅勒烯、反式芳樟醇氧化物、順式芳樟醇氧化物以及 Zhang等人[13]所報(bào)道的速溶烏龍茶粉主要揮發(fā)性成分 3，5-二甲基苯酚、3，7-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-醇、2-甲基呋喃、辛醛對(duì)比也不一致，其原因可能是不同的速溶茶粉生產(chǎn)工藝會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分的差異。

β-葡萄糖苷酶處理后速溶烏龍茶粉主要揮發(fā)性成分為順式-3-己烯醇、香葉醇、苯甲醛、癸醛、反式-β-羅勒烯、2-甲基呋喃、2-乙基呋喃和2，4-二叔丁基苯酚。酶處理后增加的揮發(fā)性成分有醇類、醛類和酯類，醇類總含量從33.07 μg/L增加到22807.5.9 μg/L，其中順式-3-己烯醇（0 vs 15416.97 μg/L）和香葉醇（0 vs 6542.42 μg/L）；醛類含量增加了 6381.47 μg/L，其中苯甲醛（0 vs 707.32 μg/L）和癸醛（41824.02 vs 47555.64 μg/L)；酯類含量增加了 405.47 μg/L，其中水楊酸甲酯（0 vs 268.81 μg/L），該結(jié)果表明β-葡萄糖苷酶作用于速溶烏龍茶粉后揮發(fā)性成分發(fā)生變化主要和糖苷類前體有關(guān)，目前從茶葉中分離出20多種糖苷，大多數(shù)為二糖苷和單糖苷，其中單糖苷以β-葡萄糖糖苷為主[23]。醇類成分中順式-3-己烯醇的前體為β-葡萄糖糖苷和β-櫻草糖苷；香葉醇的前體為β-葡萄糖糖苷、β-櫻草糖苷和香葉基-β-巢菜糖苷[6]，因此，在β-葡萄糖苷酶的作用下可以生成順式-3-己烯醇和香葉醇，這與文獻(xiàn)[24]的報(bào)道一致；醛類成分的變化與文獻(xiàn)[25,26,27]的報(bào)道相一致，有學(xué)者利用黑曲霉胞外酶處理速溶綠茶粉后苯甲醛增加，并且已有研究表明黑曲霉胞外酶中含有β-葡萄糖苷酶，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道苯甲醛前體為野黑櫻苷，糖基部分為β-葡萄糖苷，所以在β-葡萄糖苷酶作用下可釋放出苯甲醛；酯類成分的變化與文獻(xiàn)[12,28]一致，其前體為β-櫻草糖苷，經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理后水楊酸甲酯、香葉醇和順式-3-己烯醇含量顯著增加。此外，醇類成分中還增加了己醇、2-庚醇、2-甲基己醇、辛醇和壬醇，其中己醇從0增加到了476.1 μg/L，這與文獻(xiàn)[29]的研究一致，經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理后，風(fēng)味前體成分可以釋放己醇、正丁醇和順式-3-己烯醇。綜合比較上述幾類香氣成分的變化，在β-葡萄糖苷酶的作用下，速溶烏龍茶粉的揮發(fā)性成分及含量具有顯著性增加。

表2 速溶烏龍茶粉水溶液以及β-葡萄糖苷酶處理后樣品揮發(fā)性成分定量表Table 2 Quantitative determination of volatile components of instant oolong tea infusion and the β-glucosidase treated sample

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注：OIOT表示速溶烏龍茶粉水溶液，EIOT表示β-葡萄糖苷酶處理速溶烏龍茶粉水溶液，nd為沒有檢測(cè)到的揮發(fā)性成分，每一行中，不同的字母（a，b）代表數(shù)值間存在著顯著性差異（p＜0.05）。

2.3 感官評(píng)價(jià)

茶的揮發(fā)性成分之間以及揮發(fā)性成分與非揮發(fā)性成分之間都存在復(fù)雜的相互作用，僅通過香氣成分的含量以及香氣成分的貢獻(xiàn)率對(duì)茶的香氣作出評(píng)價(jià)是不夠的。為此，依照1.4.4的方法對(duì)樣品進(jìn)行感官分析，結(jié)果如表 3。速溶烏龍茶粉水溶液以甜香和焦糖香為主，經(jīng)過β-葡萄糖苷酶處理后，青草香、花香、果香

顯著增強(qiáng)，而焦糖香大幅度降低，整體香味以青草香、花香、果香為主，此結(jié)果與文獻(xiàn)[13]的報(bào)道相似。其原因可能是β-葡萄糖苷酶與茶粉中糖苷類前體發(fā)生反應(yīng)，促進(jìn)了花香、青草香和果香揮發(fā)性成分的釋放，例如順式-3-己烯醇、苯甲醛、水楊酸甲酯等，從而使速溶烏龍茶在加工過程中產(chǎn)生的不良風(fēng)味得到改善，焦糖香顯著減少，也可能是因?yàn)榍嗖菹恪⒒ㄏ愫凸愕脑黾友谏w了焦糖香，使得整體香氣更加柔和。

表3 速溶烏龍茶粉水溶液以及β-葡萄糖苷酶處理后樣品感官評(píng)價(jià)表Table 3 Sensory evaluation of instant oolong tea infusion and the β-glucosidase treated sample

為進(jìn)一步分析酶處理后速溶烏龍茶粉水溶液整體香氣的變化，對(duì)花香、青草香、甜香、果香和焦糖香進(jìn)行主成分分析，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 感官評(píng)價(jià)的主成分及得分散點(diǎn)圖Fig.2 Principal components and scatter plot of sensory evaluation scores

由圖2a可知，主成分1（PC 1）可以解釋總變量的68.5%，與甜香、花香、青草香和果香的感官評(píng)價(jià)數(shù)值呈現(xiàn)正相關(guān)，與焦糖香數(shù)值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。主成分2（PC 2）可解釋總變量的17.5%，與甜香和花香和焦糖香的感官評(píng)價(jià)數(shù)值呈現(xiàn)正相關(guān)，與果香和青草香數(shù)值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。從速溶烏龍茶粉水溶液和酶處理后的樣品主成分分析散點(diǎn)圖來看（圖 2b），兩者之間存在顯著差異，此結(jié)果進(jìn)一步表明，β-葡萄糖苷酶處理后速溶烏龍茶粉水溶液的香氣得到顯著改善，可將其應(yīng)用于茶飲料等產(chǎn)品生產(chǎn)的前處理環(huán)節(jié)中，提高相關(guān)產(chǎn)品的風(fēng)味。

2.4 香氣強(qiáng)度值（OAVs）分析

為更直觀反映速溶茶粉的香氣結(jié)構(gòu)，參考相關(guān)文獻(xiàn)已報(bào)道的閾值并結(jié)合GC-MS檢測(cè)結(jié)果計(jì)算各揮發(fā)性成分的 OAVs，如表4所示。β-葡萄糖苷酶處理后香氣強(qiáng)度總值為2107.8，比處理前增加了約14%，其中貢獻(xiàn)較大的成分有順式-3-己烯醇（220.2）、香葉醇（163.6）、3-甲基丁醛（366.0）、2-乙基呋喃（311.1）和癸醛（792.6），占總香氣強(qiáng)度的88%。其中順式-3-己烯醇和香葉醇有較低的閾值、較高的香氣強(qiáng)度值，賦予速溶烏龍茶粉青草香和玫瑰香，這就進(jìn)一步解釋了感官評(píng)價(jià)中經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理后的速溶烏龍茶粉具有更強(qiáng)的青草香和花香。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[13,15]的報(bào)道基本相一致，只是不同的速溶茶粉香氣有一定的差異，這主要是由于加工方式不同導(dǎo)致的差異。

表4 速溶烏龍茶粉水溶液以及β-葡萄苷酶處理后樣品香氣強(qiáng)度值Table 4 Odor activity values of instant oolong tea infusion and β-glucosidase treated sample

3 結(jié)論

通過GC-MS分析表明β-葡萄糖苷酶處理前后速溶烏龍茶粉水溶液共鑒定出37種揮發(fā)性成分，其中速溶烏龍茶粉水溶液中鑒定出26種，β-葡萄糖苷酶處理的樣品中鑒定出35種。經(jīng)過β-葡萄糖苷酶處理后，順式-3-己烯醇、己醇、香葉醇、苯甲醛和水楊酸甲酯等成分的含量顯著增加；青草香、花香、果香顯著增強(qiáng)，而焦糖香大幅度降低；順式-3-己烯醇和香葉醇的香氣強(qiáng)度值大幅度增加。該研究結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶可用于處理速溶茶粉水溶液，從而提高茶葉飲料、茶糕點(diǎn)等產(chǎn)品的風(fēng)味。