李 超，陳金鳳，宋彩玲，龐巍建，張博文，劉 剛

（1. 青島海華生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，山東青島 266555；2. 青島海潤檢測股份有限公司，山東青島 266555）

毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)已成為山東省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā) 展的新增長點(diǎn)。近年來，毛皮動物養(yǎng)殖量和養(yǎng)殖密度不斷增加，毛皮動物及毛皮交易日益頻繁，疫病發(fā)生和流行亦變得日趨復(fù)雜[1]。犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）是引起犬科、鼬科及一部分浣熊科或其他食肉目動物犬瘟熱（Canine distemper，CD）的病原[2]，屬副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus），為單股、不分節(jié)段、負(fù)鏈RNA病毒。

目前CDV在世界范圍內(nèi)廣泛流行，感染宿主范圍不斷擴(kuò)大，多種動物都可感染[3]。CDV只有1個(gè)血清型。CDV血凝素蛋白（H）是CDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，能夠產(chǎn)生中和抗體，在犬瘟熱免疫預(yù)防方面起著重要作用。在麻疹病毒屬所有結(jié)構(gòu)蛋白中，H 蛋白基因變異最大，抗原變化最高。根據(jù)CDV H基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分支上，同源性高于95%的毒株可歸為同一基因型的原則[4]，目前CDV主要分為Asia-1、Asia-2、America-1（Vaccines）、America-2、Europe、European wildlife、Arctic 7 個(gè)基因型[5]。本研究根據(jù)山東省威海、青島等市水貂養(yǎng)殖場病死貂的發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化、CDV檢測，結(jié)合細(xì)菌分離鑒定和動物試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析CDV與細(xì)菌混合感染的比例，并對RT-PCR檢測陽性病料進(jìn)行CDV H蛋白基因測定，研究分析CDV H基因的分子進(jìn)化和變異情況，為規(guī)?；B(yǎng)殖場疫病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料樣品 采集2017年山東省威海、青島、臨沂等市16個(gè)毛皮動物養(yǎng)殖場送檢的病死水貂、狐貍、貉子等的腦、肺、肝、脾等臟器。每個(gè)養(yǎng)殖場送檢1只，共計(jì)16只。

1.1.2 細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)所用試劑材料 營養(yǎng)瓊脂（NA）、西蒙式枸櫞酸鹽瓊脂（SCA）、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、SS 瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基等：購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌單因子血清：購于中國獸藥監(jiān)察所；血瓊脂平板：自行配置；微量生化鑒定管：購自杭州天和微生物試劑有限公司；BALB/c小鼠：購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、蒸餾水、無菌水、結(jié)晶紫、番紅、碘液、香柏油等試劑材料：均由青島海華生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 病毒學(xué)試驗(yàn)所用試劑材料 反轉(zhuǎn)錄酶Superscript III Reverse Transcriptase：購自Invitrogen公司；RNA酶抑制劑、LA-Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2 000 bp DNA Marker、pMD19-T載體試劑盒：購自大連寶生物工程有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA提取試劑盒：購自北京全式金生物技術(shù)有限公司公司；X-gal、IPTG：購自Promega公司；DEPC：購自Sigma公司；氨芐青霉素鈉鹽（Amp）、焦磷酸二乙酯（DEPC）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒：OMEGA公司產(chǎn)品；無水乙醇、EDTA、氯仿、瓊脂糖、溴酚蘭：購自天津化學(xué)試劑三廠；異丙醇：購自上海埃彼化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料處理 用無菌剪刀剪取病死動物的腦、肺、肝、脾等臟器組織，各分為2份：一份加少量滅菌PBS（含青霉素、鏈霉素各1 000 U/mL），放入滅菌研缽內(nèi)研磨成勻漿，反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清用0.22 μm的無菌濾器除菌，分裝入無菌EP管內(nèi)，?80 ℃保存?zhèn)溆?；另外一份用于?xì)菌分離。

1.2.2 細(xì)菌分離 用接種環(huán)無菌取病料，采用平板劃線法接種于營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，分別在37 ℃需氧和厭氧條件下培養(yǎng)1 d，再挑取單菌落在適宜培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)，如此反復(fù)，直到培養(yǎng)基上的菌落特征相同時(shí)，再挑取單個(gè)菌落，涂片、染色、鏡檢，觀察菌體大小和染色特征；將分離菌株分別接種麥康凱瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板和SS瓊脂平板，分別在需氧和厭氧條件下，37 ℃培養(yǎng)2 d后，觀察菌落形態(tài)及生長情況。

1.2.3 分離細(xì)菌的鑒定 先進(jìn)行革蘭氏染色和形態(tài)學(xué)鑒定，然后將分離菌株分別接種于含有枸櫞酸鹽、尿素酶、木糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、ONPG、甘露醇、肌醇等微量生化試管，37 ℃培養(yǎng)1～7 d，觀察和記錄試驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行生化特性鑒定；將分離純化的細(xì)菌接種于TSB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，然后提取分離菌株的基因組DNA。采用引物16S-F：5'-GAGTTTGATCCTGGCTC-3'，16S-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACT-3'擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA；將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序，對獲得的基因序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行基因序列同源性比對，進(jìn)行細(xì)菌種屬鑒定和分子生物學(xué)鑒定；將鑒定好的菌株全部放入37 ℃ LB肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，?80 ℃下保存于含25%甘油的無菌生理鹽水中。

1.2.4 病毒RNA提取 按EasyPure Viral DNA/RNA提取試劑盒說明書提取。

1.2.5 樣品RT-PCR檢測 按照文獻(xiàn)[6]，合成1對CDV診斷引物P1/P2，可擴(kuò)增CDV NP基因的242 bp目的條帶，退火溫度為55 ℃。所用引物序列見表1。

表1 本試驗(yàn)應(yīng)用的引物序列

1.2.6 H基因克隆和測序 按照Bi等[7]所設(shè)計(jì)的引物，合成1對CDV H基因測序引物CDV-P3/P4，可擴(kuò)增CDV H基因1 824 bp的目的條帶；采用寶生物膠回收試劑盒，對經(jīng)電泳檢測與預(yù)期大小片段相符的條帶進(jìn)行回收后，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)涂板、搖菌后進(jìn)行陽性克隆鑒定；將鑒定為陽性的菌液，送北京六合華大基因公司測序。

1.2.7 H基因序列分析 從GenBank中下載已知的CDV H基因序列（參考毒株詳細(xì)信息見表2），用MegAlign軟件與測得的基因序列進(jìn)行核苷酸序列比較，分析序列間的同源性及氨基酸序列差異。將全部序列導(dǎo)入MEGA 5.1軟件，采用最大擬然法，繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.8 大腸桿菌O抗原制備及血清型鑒定 將已純化培養(yǎng)的大腸桿菌菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，37 ℃培養(yǎng)1 d；用5 g/L石炭酸生理鹽水2 mL洗脫菌苔，制成濃稠菌懸液，121 ℃高壓2 h，破壞其K、H抗原，得到O抗原；通過玻板凝集試驗(yàn)，用標(biāo)準(zhǔn)O型分型血清，對分離菌株進(jìn)行血清型鑒定，同時(shí)以檢測抗原與石碳酸生理鹽水混合物作為對照，觀察有無自凝現(xiàn)象，若1 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集，則判為陽性。

1.2.9 分離菌的BALB/c小鼠致病力試驗(yàn) 將分離純化的細(xì)菌，采用平板計(jì)數(shù)法確定注射菌液的活菌濃度約為1×109個(gè)/mL。將0.2 mL該菌TSB純培養(yǎng)液腹腔接種體重約20 g的BALB/c小鼠10只，另設(shè)5只小鼠作為正常對照，僅腹腔接種0.2 mL無菌生理鹽水，觀察1 d內(nèi)小鼠發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 病理變化

剖檢結(jié)果顯示，病死毛皮動物表現(xiàn)不同程度的腦膜充血、間質(zhì)性肺炎、出血性肺炎、肝臟黃疸及腎臟腫大等顯著的病理變化（圖1）。

圖1 毛皮動物臨床解剖病理變化觀察結(jié)果

2.2 細(xì)菌感染情況

細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果顯示：16只病死毛皮動物的肝臟和肺臟中均分離出細(xì)菌，細(xì)菌分離率達(dá)100%，其中綠膿桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、溶血葡萄球菌、β溶血性鏈球菌的分離率分別為35%、30%、5%、5%、5%、5%、5%、5%。細(xì)菌致病性試驗(yàn)顯示，不同綠膿桿菌分離株對小白鼠均有高致病力，不同血清型大腸桿菌的致病力存在差異，溶血葡萄球菌、β溶血性鏈球菌分離株對小白鼠無致病。具體細(xì)菌分離情況和致病性試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 2017年山東省部分地區(qū)毛皮動物細(xì)菌分離情況與致病性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病料RT-PCR檢測

以CDV P1/P2為引物，以試劑盒提取的病毒RNA為模版，經(jīng)RT-PCR檢測，電泳得到約242 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。經(jīng)檢測，16份病料中，共檢測出11份CDV陽性，檢出率為68.8%。

圖2 病料的CDV RT-PCR檢測結(jié)果

2.4 陽性病料的CDV H全基因擴(kuò)增

采用引物CDV-P3/P4，將11份陽性病料進(jìn)行CDV H基因RT-PCR擴(kuò)增，電泳得到約1 824 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。

圖3 陽性病料CDV H 基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 CDV H基因遺傳進(jìn)化分析

將測得的11個(gè)CDV H基因序列和26株國內(nèi)外CDV參考毒株H基因核苷酸序列，應(yīng)用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（圖4）：所有毒株被分成7個(gè)基因型；本研究分離到的9株CDV毒株屬于Asia-1型，與我國絕大部分毒株基因型相同，均處在一個(gè)分支，屬野毒株，2株屬于America-1（Vaccines）型，與疫苗株處在一個(gè)分支，可能是疫苗毒。

2.6 CDV H基因同源性分析

圖4 CDV野毒株與參比毒株H基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖5 山東省部分地區(qū)CDV與疫苗株H基因同源性分析

測序結(jié)果顯示，11株CDV毒株的H基因編碼區(qū)全基因序列全長1 824 bp，共編碼607個(gè)氨基酸。使用MegAlign對CDV H基因測序結(jié)果與疫苗毒株序列進(jìn)行多重序列比對分析，發(fā)現(xiàn)山東省這些地區(qū)的CDV野毒株的核苷酸同源性為99.0%～100%，與疫 苗 株 CDV11、CDV3、Onderstepoort、Convac、Snyder Hill、Lederle的核苷酸同源性為90.1%～91.1%（圖5）。

3 討論

動物機(jī)體抵抗力下降和飼養(yǎng)管理水平低下時(shí)，都可能引起大腸桿菌等條件性致病菌感染，因此應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，創(chuàng)造良好的養(yǎng)殖環(huán)境，以減少細(xì)菌病，尤其是條件性致病菌病的發(fā)生。毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)正朝著集約化方向發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷增大，細(xì)菌病在臨床上危害需引起足夠重視。毛皮動物飼養(yǎng)場需要做好CDV弱毒疫苗免疫工作，加強(qiáng)日常消毒，保證養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生。

犬瘟熱發(fā)病率高，治愈率低，給我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)帶來很大危害，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失慘重。近年來，世界多個(gè)國家和地區(qū)都有免疫動物暴發(fā)犬瘟熱疫情的報(bào)道。在免疫壓力下，H 蛋白抗原容易發(fā)生漂變，這可能是導(dǎo)致目前犬瘟熱免疫失敗的重要原因[8-9]。本試驗(yàn)采集山東部分地區(qū)病料，利用RT-PCR方法對CDV H 基因進(jìn)行擴(kuò)增并測序，并將H 基因序列與GeneBank上以發(fā)表的對應(yīng)H 基因作序列比較分析，發(fā)現(xiàn)H 基因編碼區(qū)的核苷酸同源性在99.0%～100%之間，與傳統(tǒng)疫苗株的同源性在90.1%～91.1%之間?；贖 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹顯示，分離出的11株CDV毒株中，有9株屬于野毒株譜系，與國內(nèi)絕大部分分離株同屬于Asia-1型，2株屬于疫苗株譜系，屬于America-1（Vaccine）基因型。這與王貴升等[1]、王聰?shù)萚10]分子流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果一致，說明其他亞型的CDV毒株暫未在山東部分地區(qū)流行。本研究通過對H 基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，闡述山東部分地區(qū)CDV的群屬，對犬瘟熱的免疫指導(dǎo)，研發(fā)適合當(dāng)前流行毒株的CDV疫苗十分必要。

革蘭氏陰性菌特別是一些毒力較弱的機(jī)會致病菌，已經(jīng)嚴(yán)重地威脅著養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，并給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10-11]。本研究分離的綠膿桿菌分離株對小白鼠具有強(qiáng)致病性，是造成毛皮動物出血性肺炎的主要病原。

本研究結(jié)果表明，綠膿桿菌和致病性大腸桿菌是威脅毛皮動物的主要致病菌。針對毛皮動物細(xì)菌及CDV混合感染情況的檢測，可以推斷犬瘟熱免疫失敗繼而造成CDV與細(xì)菌混合感染，可能是導(dǎo)致毛皮動物大規(guī)模死亡的一個(gè)重要原因，這為規(guī)?；游镳B(yǎng)殖場有效地控制疫病提供了一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究采集山東威海、青島、臨沂等市水貂養(yǎng)殖場16只病死貂病料，進(jìn)行CDV檢測和細(xì)菌的分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) CDV和細(xì)菌混合感染較為普遍，檢出率為68.75%；混合感染的細(xì)菌種類復(fù)雜，共分離到綠膿桿菌、大腸桿菌等8種菌株。CDV分離毒株大部分屬于野毒株譜系，與國內(nèi)絕大部分分離株同屬于Asia-1型，說明其他亞型的CDV毒株暫未在山東地區(qū)流行。分離到的綠膿桿菌和大腸桿菌致病性較強(qiáng)，是威脅毛皮動物的主要致病菌。綜合認(rèn)為，CDV與致病細(xì)菌的混合感染可能是導(dǎo)致這些地區(qū)毛皮動物大規(guī)模死亡的一個(gè)重要原因。