袁向芬，馮春燕，呂繼洲，吳紹強(qiáng)

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100176）

羅斯河病毒（Ross River virus，RRV）屬披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒屬（Alphavirus），是一種蟲媒性人獸共患病病原，目前主要流行于澳大利亞以及巴布亞新幾內(nèi)亞等南太平洋島嶼國家[1-2]。研究者已在40多種蚊子體內(nèi)分離到RRV，其中包括伊蚊、庫蚊等。除蚊子外，RRV的脊椎動(dòng)物宿主主要為負(fù)鼠、袋鼠、小袋鼠等有袋動(dòng)物和人類[3-5]。在澳大利亞，該病的平均年病例數(shù)量高達(dá)5 100例，約為其他所有蟲媒病病例總和的10倍[6-7]。RRV雖不致命，卻可導(dǎo)致多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、肌肉痛、發(fā)燒及慢性關(guān)節(jié)痛等癥狀，并可持續(xù)發(fā)作數(shù)周，甚至數(shù)月，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)500萬美元。RRV偶爾還會(huì)引發(fā)大規(guī)模疫情，造成更大損失。如，2015年澳大利亞發(fā)現(xiàn)了9 800例RRV感染病例，是其他年平均值的兩倍；2017年1—2月，維多利亞州發(fā)現(xiàn)了1 200例病例，是該地以往4年病例數(shù)的總和[8]。目前，針對RRV感染，尚缺乏有效的治療方法及商業(yè)化疫苗，僅可通過蚊蟲管理、及時(shí)監(jiān)控等預(yù)防性措施進(jìn)行防控。

我國目前也存在RRV。早在1997年，趙春生等[9]在海南省蝙蝠腦中分離出1株病毒，最終判定為RRV，提示海南省可能存在RRV自然疫源地[10]；2012年，葉緒芳等[11]對2005—2008年在貴州省采集的不明原因發(fā)熱病例、病毒性腦炎病例以及健康人群的血液進(jìn)行了RRV抗體檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率分別為2.94%、3.52%和1.15%，且抗體陽性病例數(shù)和分布縣數(shù)呈逐年增加趨勢，提示貴州省也存在RRV感染。另外，隨著國際活動(dòng)及貿(mào)易的不斷擴(kuò)大，我國往返澳大利亞的航班及船舶日益增多，每年均會(huì)從澳大利亞等地進(jìn)口活體袋鼠及袋鼠皮張等相關(guān)產(chǎn)品，RRV極有可能經(jīng)進(jìn)境人員、易感動(dòng)物及相關(guān)制品引入國內(nèi)，因此我國亟須加強(qiáng)RRV監(jiān)測和研究，做好技術(shù)儲(chǔ)備。

目前，國外針對RRV的檢測方法主要有病毒分離、血清學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測[12-16]。雖然病毒分離仍為金標(biāo)方法，但耗費(fèi)時(shí)間長，需細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備及專業(yè)人員。而血清學(xué)方法主要通過免疫捕獲ELISA完成，在對蚊子等小樣本進(jìn)行檢測時(shí)，易產(chǎn)生因病毒濃度低導(dǎo)致的假陰性問題。相比之下，基于核酸擴(kuò)增的分子檢測方法更為簡單、靈敏、快速，且適用于微量樣品中靶基因的檢測[17-18]。本研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，建立了一種快速檢測RRV基因的方法，同時(shí)與熒光定量RT-PCR及常規(guī)RTPCR方法[19]進(jìn)行了比較，證實(shí)本方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，無需特殊儀器及專業(yè)人員，可應(yīng)用于我國RRV監(jiān)測及研究。

1 材料與方法

1.1 材料

羅斯河病毒（RRV）E基因：通過全基因合成獲得，由北京華大基因有限公司合成，用于方法的建立及靈敏度、特異性驗(yàn)證；西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）、登革熱病毒（Dengue virus，DV）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）基因組：均為本實(shí)驗(yàn)室保存；65份蚊子樣品：采集自云南省，于本實(shí)驗(yàn)室保存。

PCR擴(kuò)增試劑GoTaq?G2 Flexi DNA Polymerase、RNA體外反轉(zhuǎn)錄試劑盒T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Production System：購自Promega公司；RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit和膠回收試劑盒Gel Extraction Kit：購自Qiagen公司；RT-LAMP試劑盒：購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司；SYBR Green I：購自Invitrogen公司；DL 2 000 bp DNA Marker及瓊脂糖粉：購自TAKARA公司。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)濁度儀LA-320c：購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司；Veriti 96孔梯度PCR儀：購自ABI公司；LightCycler?480II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：購自Roche公司；電泳儀：購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 本研究以RRV保守的包膜蛋白基因E2為靶序列，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explore V5設(shè)計(jì)并篩選了一套引物（共6條引物）：1對外引物（F3/B3），1對內(nèi)引物（FIP/BIP）及1對環(huán)引物（LF/LB）。另外在外引物上游F3的5'端引入T7啟動(dòng)子序列，與B3一起用于RRV反轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備。相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品制備 以全基因合成的RRV-E2質(zhì)粒為模板，以含有T7啟動(dòng)子序列的T7-F3/B3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參照RNA體外反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊進(jìn)行cRNA合成，用乙醇沉淀法洗滌產(chǎn)物3次，并用DNAse去除產(chǎn)物中殘留的DNA模板，然后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。用Nanodrop對回收到的cRNA產(chǎn)物進(jìn)行定量，并利用下面公式進(jìn)行濃度換算：[ 6.02×1023× 濃 度 (ng/μL)×10-9] / (DNA 長度×340) = 拷貝/μL；將RNA 10倍系列稀釋為1×100、1×101……1×108拷貝 /μL，分裝后置于?80 ℃超低溫冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 RNA提取 按照RNA提取試劑盒操作手冊，提取實(shí)驗(yàn)室保存的65只蚊子RNA，用60 μL DEPC水洗脫，置于?80 ℃冰箱備用。

1.2.4 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 利用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀，實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，主要對反應(yīng)溫度、引物濃度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 按照優(yōu)化好的反應(yīng)體系及條件，以RRV E基因以及WNV、DV、JEV基因組為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn) 以制備好的一系列cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行RT-LAMP靈敏度驗(yàn)證，同時(shí)用熒光RT-PCR及常規(guī)RT-PCR進(jìn)行比較驗(yàn)證。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別以陰性樣品以及1×102、1×104、1×106拷貝/μL的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行檢測，對每種樣品分別設(shè)3個(gè)平行對照，記錄濁度達(dá)到0.2時(shí)所對應(yīng)的時(shí)間，據(jù)此計(jì)算變異系數(shù)，以驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性。

1.2.8 樣本檢測 用建立的RT-LAMP檢測方法，檢測提取的蚊子RNA樣本，并與熒光定量RT-PCR及常規(guī)RT-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系及條件確定

經(jīng)過對反應(yīng)溫度、引物濃度及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，確定RRV RT-LAMP法的反應(yīng)體系（25 μL）為：FIP（20 μmol/L）和 BIP（20 μmol/L）各 2 μL，F(xiàn)3（5 μmol/L） 和 B3（5 μmol/L） 各 1 μL，LF（20 μmol/L）和 LB（20 μmol/L）各 1 μL，2×Reaction Mix 12.5 μL[Tris-HCl（pH8.8）40 mmol/L、KCl 20 mmol/L、MgSO416 mmol/L、(NH4)2SO420 mmol/L、Tween20 0.2%、Betaine 1.6 mol/L、dNTPs 2.8 mmol/L]，Enzyme Mix 1.0 μL，RNA 1 μL，DEPC 水 2.5 μL。反應(yīng)結(jié)果既可根據(jù)實(shí)時(shí)濁度儀記錄的濁度曲線進(jìn)行，也可在反應(yīng)前于反應(yīng)管內(nèi)加入 1 μL 熒光試劑FDR，反應(yīng)后直接通過顏色變化來判定反應(yīng)結(jié)果，還可通過觀察反應(yīng)后是否產(chǎn)生白色沉淀來判定反應(yīng)結(jié)果。優(yōu)化的反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃恒溫作用1 h。該程序既可在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，也可在金屬浴及各種核酸擴(kuò)增儀等儀器中進(jìn)行。

2.2 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究建立的LAMP檢測方法僅與RRV E基因發(fā)生反應(yīng)，與其他相近病毒無交叉反應(yīng)，特異性良好（圖1）。

圖1 RRV RT-LAMP方法特異性分析

2.3 靈敏度試驗(yàn)

靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的RRV RT-LAMP檢測方法的最低檢測限為10拷貝/25 μL，與濁度法、染料法及沉淀法3種判定方法（圖2），以及熒光定量RT-PCR法的靈敏度相同，但比常規(guī)RT-PCR的靈敏度高10倍（圖3）。

圖2 RRV RT-LAMP靈敏度分析

圖3 RRV 熒光RT-PCR及常規(guī)RT-PCR靈敏度分析

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

實(shí)時(shí)濁度儀記錄的數(shù)據(jù)顯示，濁度達(dá)到0.2時(shí)，強(qiáng)陽性樣本及臨界值樣本反應(yīng)時(shí)間的變異系數(shù)均小于5%，表明穩(wěn)定性良好（表2）。

表2 RRV LAMP穩(wěn)定性分析

2.5 樣本檢測

用建立的RRV RT-LAMP檢測方法，對實(shí)驗(yàn)室保存的65份蚊子樣本進(jìn)行檢測，在陰陽性對照成立的基礎(chǔ)上并未發(fā)現(xiàn)陽性樣品，與熒光定量RTPCR及常規(guī)RT-PCR的檢測結(jié)果相同。

3 討論

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一種新型分子診斷技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[20]，且僅利用簡單的恒溫水浴設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)對特異性靶基因的高效擴(kuò)增，因此在分子診斷領(lǐng)域擁有巨大潛力，已被廣泛應(yīng)用于病原微生物及物種鑒定、疫病現(xiàn)場檢測、臨床診療等研究領(lǐng)域[21-24]。已有國內(nèi)專家推測，云南省附近可能存在RRV自然疫源地。RRV是一種蟲媒介導(dǎo)的人獸共患病病原，其對人類具有潛在危脅。常規(guī)的RT-PCR檢測方法靈敏度欠缺，而熒光定量RT-PCR成本較高且需要專業(yè)的儀器設(shè)備，因此都不適用于臨床樣本的大量篩查。本研究建立的RT-LAMP檢測方法成本低廉、反應(yīng)迅速、靈敏度及特異性良好，且可根據(jù)實(shí)際情況選擇不同的結(jié)果判定方式，是一種理想的疫病篩查工具，可為RRV監(jiān)測及預(yù)警提供技術(shù)支撐。

本研究對臨床收集的65分蚊子樣品的檢測均為陰性，且與熒光RT-PCR及常規(guī)RT-PCR的檢測結(jié)果相同，與目前國內(nèi)并未在蝙蝠以外動(dòng)物體內(nèi)分離到RRV的報(bào)道現(xiàn)狀相符。但因本研究搜集的蚊子樣本多來自內(nèi)蒙古、北京等地，所以需要今后在云南等易感地區(qū)做進(jìn)一步監(jiān)測。

另外，對于LAMP技術(shù)本身而言，最突出的不足在于易出現(xiàn)氣溶膠污染所導(dǎo)致的假陽性。然而，普通LAMP法包含4條引物（1對外引物和1對內(nèi)引物），針對靶序列的6個(gè)特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)而成，理論上應(yīng)比僅有2條引物的PCR方法特異性更強(qiáng)，因此考慮 LAMP的假陽性多為其自身擴(kuò)增產(chǎn)物開蓋操作所致。由于LAMP產(chǎn)物濃度非常高，可達(dá)模板濃度的1010倍，因此極易產(chǎn)生氣溶膠污染，而在常規(guī)樣本檢測工作中，樣本提取的病毒RNA濃度很難達(dá)到如此高，且RNA極易降解，如果能避免擴(kuò)增后的開蓋操作（電泳鑒定等），其假陽性率應(yīng)與靈敏度相似的熒光RT-PCR方法相當(dāng)，因此在LAMP方法的應(yīng)用中，應(yīng)嚴(yán)格避免開蓋操作，同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分區(qū)，這樣可很大程度降低LAMP的假陽性率，增加其實(shí)用性。另外，LAMP最大的優(yōu)勢在于快速、靈敏且不需要復(fù)雜儀器，然而在臨床診斷中，缺乏與之配套的、同樣簡單快速的樣品前處理方案，這也是限制LAMP推廣應(yīng)用的另一個(gè)重要因素。雖然通過十幾年的研究探索，國內(nèi)外研究者提出了很多解決方案，也取得了一些進(jìn)展，但其樣本前處理技術(shù)距臨床應(yīng)用還有很大距離，需要進(jìn)一步探索與創(chuàng)新。

4 結(jié)論

本研究建立的RRV RT-LAMP檢測方法特異性良好，不與同屬或相近病毒發(fā)生交叉反應(yīng)；最低檢測限可達(dá)10拷貝/反應(yīng)，與熒光定量RT-PCR靈敏度相當(dāng)；樣品檢測僅需1 h，相較于PCR法可節(jié)省1 h左右時(shí)間；操作簡單，無需特殊儀器設(shè)備，簡單的水浴鍋即可滿足要求；擴(kuò)增結(jié)果判定方式多樣化，可根據(jù)需求，借助實(shí)時(shí)濁度法、沉淀法或染料法進(jìn)行。綜合認(rèn)為，本研究建立的RRV RT-LAMP檢測方法可應(yīng)用于我國蟲媒病高發(fā)區(qū)的RRV篩查預(yù)警。