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        6種人獸共患病病原核酸液相芯片檢測體系的建立

        2018-12-21 09:29:58沈家紅張磊萍林穎崢李樹清
        中國動物檢疫 2018年12期
        關鍵詞:體系檢測

        王 艷,沈家紅,蔣 蔚,張磊萍,張 強,林穎崢,熊 煒,李樹清

        (1. 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心,上海 200135;2. 上海市浦東新區(qū)動物疫病預防控制中心,上海 201299;3. 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

        布魯氏菌?。˙rucellosis,以下簡稱布?。┦怯刹剪斒暇˙rucella)感染引起的一種全球分布的人獸共患病,主要影響感染宿主泌尿生殖系統(tǒng),不僅會給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失,還會嚴重影響人類健康[1-2]。沙門氏菌(Salmonella)是一類人獸共患病原菌[3],廣泛分布于自然界中,其中鼠傷寒沙門氏菌是最常見的一種血清型,鼠類可以傳播本病。弓形蟲?。═oxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)感染引起的一種高度流行的人獸共患病,可給畜牧業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[4-5]??袢∈怯煽袢〔《緦伲↙yssavirus,LV)引起的一種高度嗜神經(jīng)、人和動物都易感的烈性傳染病[6]。漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)是一種革蘭氏陰性棒狀短小桿菌,近年來在許多家養(yǎng)和野生哺乳動物中(包括家養(yǎng)犬、貓,野生貓科、犬科動物,嚙齒動物和反芻動物)都已檢測到[7],人也可感染,因而備受關注。彎曲菌屬(Campyolbacter)是20世紀70年代命名的一群革蘭氏陰性微需氧的彎曲或螺形菌。研究表明實驗動物腸道內也存在彎曲菌感染[8]。

        本研究以布魯氏菌、沙門氏菌、弓形蟲、狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌這6種重要人獸共患病病原為對象,基于多重PCR技術的液相芯片檢測體系,建立了能同時檢測這6種病原的檢測方法,并對其靈敏度、特異性等指標進行驗證。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        鏈霉素-親和素-藻紅蛋白(SAPE):購自美國Invitrogen公司;表面羧基化的熒光編碼微球:購自美國Bio-Rad公司;Luminex 200液相芯片檢測儀:美國Luminex公司產品;沙門氏菌(Sal)、布魯氏菌(Bru)、弓形蟲(Tox)質粒:由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所友情饋贈;狂犬病病毒(Rab)、巴爾通體(Bar)、彎曲桿菌(Camp)質粒:由上海出入境檢驗檢疫局動物檢疫實驗室保存。所有質粒均克隆在PUC57載體上;將制備的質粒采用雙純水配制成500拷貝/μL的濃度,?20 ℃保存?zhèn)溆?。所有樣品均為進出境實驗動物拭子或全血樣品。

        1.2 方法

        1.2.1 探針及引物的設計和合成 根據(jù)GenBank登錄的沙門氏菌、布魯氏菌和弓形蟲基因序列,應用Primer 5.0序列分析軟件進行序列分析、引物、探針設計,使探針的Tm值盡量保持在56~58 ℃,分別在探針的上下游設計特異性的擴增引物(表1)。引物、探針送上海生物工程有限股份公司合成。將引物用水溶解成200 mmol/L的貯存母液備用。

        1.2.2 單對引物及多重引物擴增性能檢測 將單對引物及多重引物,分別對多目的基因進行擴增,以鑒定引物的特異性。單重PCR反應配制為:10×buffer(Mg2+)2.5 μL、dNTP(2.5 mol/L)1.0 μL、引物 1.0 μL、模板 2.0 μL、HotstarTaq 0.5 U、ddH2O 18.5 μL,總 PCR 體系為 25 μL。多重 PCR引物加入量為:BruF1/R2 2.5 pmol,SalF1/R1 2.0 pmol,ToxF3/R5 1.0 pmol,RabF2/R1 2.0 pmol,BarF4/R2 2.5 pmol,CampF1/R3 1.0 pmol。PCR 擴增程序為:95 ℃預變性 3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃30 s,72 ℃ 20 s,35 個循環(huán),72 ℃再延伸 1 min。反應結束后,取5 μL PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上行電泳檢測。

        表1 探針和引物序列

        1.2.3 微球探針交聯(lián) 取相應的熒光編碼微球100 μL(表 2),5 000 r/min 離心 10 min 后棄上清,用雙蒸水洗滌2次;用100 μL 0.1 mol/L pH6.0的MES重新懸浮后,加入0.2 nmol/μL的探針3 μL,充分混勻后,加入15% EDC,37 ℃避光孵育30 min;離心棄上清,用0.1% SDS洗滌2次,用50 μL TE緩沖液(pH8.0)重新懸浮后,4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

        表2 探針名稱及對應編碼微球

        1.2.4 雜交捕獲檢測 取PCR產物5 μL,加入微球溶液25 μL(每種微球按照2 000個/25 μL),充分混合均勻后,先94 ℃變性3 min,再50 ℃孵育30 min;接著加入 SA-PE(濃度 0.2 μg/μL)70 μL,繼續(xù)孵育20 min;將Luminex 200加熱板加熱到50 ℃,并調整至度數(shù)狀態(tài)。孵育結束后直接上機讀取信號。根據(jù)Luminex公司推薦的判定標準,當每種熒光編碼微球個數(shù)不小于20個,且背景空白熒光強度不高于300時,表明試驗成立,可以進行結果判定。

        1.2.5 探針特異性檢測 按照每個反應25 μL體系,將6種微球混合,對每對單一引物進行雜交,以檢測探針的特異性。

        1.2.6 液相芯片檢測體系建立 將特異性好的探針與多重PCR產物混勻雜交,設置儀器為同時檢測6種熒光編碼微球。取20份陰性樣品,采用建立的液相芯片法進行檢測,計算每種特異性檢測微球平均熒光強度(Median fluorescent intensity,MFI)的均數(shù)和標準差,以均數(shù)+3倍標準差所得的值作為對應檢測指標的cut-off值,確定閾值,高于cut-off值就視為陽性。

        1.2.7 液相芯片檢測體系特異性 提取其他方法確定為陽性的沙門氏菌、布魯氏菌、弓形蟲、狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌、小鼠肝炎病毒(MHV)、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、仙臺病毒(SeV)、小鼠肺炎病毒(MPV)的DNA,并以此作為PCR擴增模板,用建立的液相芯片法進行雜交檢測。

        1.2.8 液相芯片檢測體系靈敏度 將Bru、Sal、Tox、Bru、Rab、Camp質粒DNA分別依次進行5、10、50倍稀釋,并分別作為PCR擴增模板,用建立的液相芯片檢測體系進行檢測。

        2 結果

        2.1 單對引物及多重引物擴增性能檢測

        電泳結果(圖1)顯示,單對引物和多重引物均能特異性擴增目的基因,表明引物具有良好的特異性。

        圖1 引物擴增性能的檢測結果

        2.2 探針特異性檢測

        6種微球對單一引物擴增產物的雜交檢測結果如表3。數(shù)據(jù)顯示,混合的6種探針針對單對引物擴增片段能有效識別捕獲,且每種探針對其余兩種目的產物沒有明顯的非特異性雜交信號,其MFI均低于100。顯示設計的探針序列針對6種擴增產物具有較好的特異性。

        2.3 液相芯片檢測體系建立

        對用其他方法確定為陰性的20份樣品,將經(jīng)DNA抽提、PCR擴增后得到的PCR產物用于液相芯片檢測,用液相芯片法測得MFI均數(shù)和標準差,計算出的閾值為91.55+3×9.83=112.04(表4)。

        2.4 液相芯片檢測體系特異性

        特異性檢測結果顯示(表5),建立的液相芯片檢測方法對 Bru、Sal、Tox、Rab、Bar、Camp有特異性雜交反應,均為陽性,而與其他重要病原病毒質粒未產生雜交反應,表明該方法具有良好的特異性。

        表3 探針特異性檢測結果

        表4 液相芯片檢測體系閾值的確定

        2.5 液相芯片檢測體系靈敏度

        采用以上確定的檢測體系,對系列濃度模板進行檢測。數(shù)據(jù)顯示,所建立的液相芯片檢測體系的檢測靈敏度大致為50拷貝/反應(表6)。

        3 討論與結論

        目前,上述6種人獸共患病的檢測方法主要有血清學方法、細菌培養(yǎng)法、細胞培養(yǎng)法。這些傳統(tǒng)的檢測方法不但耗時費力,而且可能會延誤疫情控制,造成更大的經(jīng)濟損失和人類健康危害。液相芯片技術是20世紀90年代中期發(fā)展起來的,被譽為后基因組時代的芯片技術。它有機整合了有色微球、激光技術、高速數(shù)字信號處理和計算機技術,具有通量大、靈敏度高、用量少等優(yōu)點。

        表5 液相芯片檢測體系特異性檢測

        表6 液相芯片檢測體系靈敏度檢測 單位:拷貝/反應

        本研究利用液相芯片技術,建立了能特異性檢測 Bru、Sal、Tox、Rab、Bar、Camp等 6種病原的液相芯片檢測方法。該檢測方法能夠對目標基因進行快速檢測,檢測靈敏度可達50拷貝/反應,特異性好。因此,本研究建立的高通量液相芯片檢測方法,對布魯氏菌、沙門氏菌、弓形蟲,狂犬病病毒、巴氏通體、彎曲桿菌6種病原的快速篩查提供了技術支撐。

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