海 玲，張愛棟，張爾珂，豆彤彤，楊學(xué)山

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

甘肅省河西走廊氣侯較為干燥，晝夜溫差較大，日照強，土壤呈沙性，富含鈣質(zhì)，非常適合釀酒葡萄的種植與生產(chǎn)[1]。隨著葡萄產(chǎn)量的增長和葡萄加工業(yè)的迅猛發(fā)展，葡萄酒釀造的副產(chǎn)物（葡萄皮、籽和果梗）迅速增長[2]。目前，除部分釀酒葡萄皮渣被用作肥料、飼料，大部分被閑置廢棄，資源化利用率較低，且造成了環(huán)境污染，嚴重制約了甘肅葡萄酒產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

葡萄皮渣中含量豐富的多酚類化合物具有較強的抗氧化活性，能夠降低炎癥，抑制腫瘤發(fā)展，具有促凋亡和抗血管生成作用。此外，多酚類物質(zhì)還能夠增加毛細血管阻力，保護心血管系統(tǒng)以及視網(wǎng)膜[3-5]。近年來，雖然有機溶劑提取法已大量應(yīng)用于多酚物質(zhì)的分離純化，但易造成二次污染，從而制約了葡萄皮渣提取物在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)的應(yīng)用[6-7]。與傳統(tǒng)提取法相比，酶法提取反應(yīng)條件溫和，綠色無污染且選擇性強，纖維素酶可破壞植物的細胞壁，有利于植物生物活性物質(zhì)的提取[6]。據(jù)文獻報道，酶法已成功應(yīng)用于黑加侖茶多酚[5]、石榴籽[7]、葡萄籽[8]和山楂葉[9]等不同植物基質(zhì)中多酚物質(zhì)的提取，而關(guān)于纖維素酶解提取葡萄皮中多酚物質(zhì)的研究則少見報道。

本研究以甘肅河西走廊產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄主栽品種赤霞珠（Cabernet Sauvignon）釀酒后的皮渣為原料，采用纖維素酶法提取其中的多酚物質(zhì)，通過單因素結(jié)合正交實驗，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期為葡萄皮渣多酚化合物的開發(fā)利用提供可行依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

原料：赤霞珠葡萄皮渣，采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院葡萄酒生產(chǎn)車間。

試劑：纖維素酶（上海源葉生物科技有限公司，酶活力400 U/mg）、Folin-Ciocalteus。

顯色劑、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、沒食子酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C PH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；TU-1810紫外-可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；TD5A-WS臺式低速離心機（東莞康潤實驗科技有限公司）；CPJ214電子天平；恒溫水浴箱等。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄皮渣多酚的提取

將酒精發(fā)酵結(jié)束后的赤霞珠葡萄皮渣去籽，置于鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥24 h，經(jīng)超碎粉碎機得到葡萄皮粉末作為實驗原料，于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。采用纖維素酶酶解、水浴浸提多酚類物質(zhì)。

1.3.2 葡萄皮渣多酚的測定

采用福林-肖卡法[10]測定葡萄皮渣多酚。吸取1 mL樣品溶液，加入5 mL蒸餾水、1 mL Folin-Ciocalteus顯色劑和3 mL 7.5%Na2CO3溶液。避光室溫下放置2 h顯色后，在765 nm波長下測定吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y=0.116x-0.02，R2=0.9995）計算樣品中多酚的質(zhì)量濃度。葡萄皮渣多酚得率按以下公式計算：

式中：ω為多酚得率，%；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液的體積，mL；m為葡萄皮渣的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素實驗設(shè)計

1.3.3.1 纖維素酶添加量對多酚得率的影響

準(zhǔn)確稱量葡萄皮粉末0.500 g，分別加入質(zhì)量為10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg的纖維素酶，在酶解溫度50℃，pH 5.0的條件下酶解2 h，離心10 min后取上清液，測定不同纖維素酶添加量下得到的葡萄皮渣多酚的得率。

1.3.3.2 酶解液pH值對多酚得率的影響

固定纖維素酶添加量，調(diào)節(jié)酶解液pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，其他操作同上。測定多酚得率，選出較佳酶解pH值。

1.3.3.3 酶解時間對多酚得率的影響

固定纖維素酶添加量和酶解pH值，設(shè)置酶解時間分別為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，其他操作同上。測定多酚得率，選擇較佳酶解時間。

1.3.3.4 酶解溫度對多酚得率的影響

固定纖維素酶添加量、酶解pH值和酶解時間，設(shè)置酶解溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，其他操作同上。測定多酚得率，選出較佳酶解溫度。

1.3.4 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取酶添加量、酶解pH值、酶解時間和酶解溫度作為實驗因素，采用L9（34）正交表，做4因素3水平實驗。通過對各組樣品多酚得率的測定，選出最佳工藝條件。實驗因素和水平設(shè)計見表1。

表1 正交實驗因素和水平

1.3.5 最佳工藝條件的驗證

按照正交實驗優(yōu)選的各參數(shù)，進行葡萄皮渣多酚最佳提取條件的驗證。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對多酚得率的影響（圖1）

圖1 不同酶添加量對多酚得率的影響

由圖1可知，隨著纖維素酶添加量的不斷增加，葡萄皮中多酚得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨向，其中酶得率為20 mg時，多酚得率達到最大值。結(jié)果表明，隨著纖維素酶添加量的增加，葡萄皮細胞壁的破碎程度進一步加大，從而更有利于細胞內(nèi)多酚物質(zhì)的溶出；當(dāng)酶得率繼續(xù)增加時，由于其底物濃度不足，使過多的酶聚集于皮渣表面，從而阻礙了細胞內(nèi)多酚物質(zhì)的擴散和溶出，使多酚得率下降[10]。因此，纖維素酶的較佳添加量為20 mg。

2.1.2 酶解液pH值對多酚得率的影響（圖2）

圖2 不同酶解pH值對多酚得率的影響

由圖2可知，當(dāng)pH值增加至5時，多酚得率達到最大值，之后隨著pH值的繼續(xù)增大，多酚得率迅速降低。這是由于pH值會影響纖維素酶的活性中心，在pH5時，酶催化的活性中心最易與底物相結(jié)合，促進了細胞破碎，從而提高了胞內(nèi)物質(zhì)的溶出比例。而當(dāng)pH值發(fā)生變化時，酶雖不會變性失活，但酶活性中心部位發(fā)生改變，從而降低酶活力，影響多酚物質(zhì)的充分擴散，使得率下降[11]。

2.1.3 酶解時間對多酚得率的影響（圖3）

圖3 不同酶解時間對多酚得率的影響

如圖3所示，隨著酶解時間的逐漸延長，葡萄皮中多酚得率不斷增加，當(dāng)酶解時間達2 h后，隨時間的延長多酚得率逐漸降低。在1.5～2.5 h時，隨著時間的延長，葡萄皮細胞壁及細胞間的阻擋層已被有效水解，使多酚物質(zhì)充分溶出[12]。而過長的處理時間易引起多酚物質(zhì)的氧化分解，使提取量降低，因此選擇酶解時間為2 h，此時效果較好。

2.1.4 酶解溫度對多酚得率的影響（圖4）

圖4 不同酶解溫度對多酚得率的影響

由圖4可知，纖維素酶提取葡萄皮中多酚的較適作用溫度是55℃。在55℃之前，隨著溫度的不斷升高，細胞內(nèi)活性物質(zhì)分子運動速率和酶促反應(yīng)隨之加快，破壁作用加強，使多酚物質(zhì)充分釋放于提取液中[13-14]；隨后，溫度的繼續(xù)升高易使多酚物質(zhì)分解，還會破壞酶的結(jié)構(gòu)，使酶活性下降，從而影響多酚得率。由此選擇55℃為較好的提取溫度。

表2 正交實驗結(jié)果

2.2 正交實驗結(jié)果

為確立酶法提取葡萄皮渣多酚的最優(yōu)工藝，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，進行L9（34）正交實驗，正交實驗結(jié)果見表2。為判斷上述4種因素對實驗結(jié)果的影響程度，應(yīng)用SPSS20.0對正交實驗結(jié)果進行方差分析，利用F檢驗判斷各因素對實驗指標(biāo)的影響程度，結(jié)果見表3。

表3 方差分析表

由表2可知，影響赤霞珠葡萄皮中多酚提取量的主次因素依次為C＞B＞D＞A，即時間＞酶解pH＞酶解溫度＞酶添加量。由表3方差分析可知，因素B和因素D顯著，因素C極顯著，即pH值、溫度和時間對葡萄皮渣多酚的得率均具有顯著性影響，而酶添加量對其無顯著性影響。纖維素酶提取葡萄皮渣多酚的最佳組合為A3B2C2D1，即酶添加量25 mg，酶解pH5，酶解時間2 h，酶解溫度50℃。

根據(jù)正交實驗所得的最優(yōu)組合（A3B2C2D1）進行驗證實驗，實驗結(jié)果表明，在此工藝條件下提取得到的葡萄皮中多酚得率達到11.238 mg/g，均高于正交實驗結(jié)果，表明本試驗優(yōu)化的工藝條件有較好的可行性。

3 結(jié)論

通過單因素結(jié)合正交實驗優(yōu)選赤霞珠葡萄皮渣多酚的提取工藝參數(shù)為酶添加量25 mg，酶解液pH5，酶解時間2 h，酶解溫度50℃。該法有效縮短了提取時間，節(jié)約了成本，而且多酚結(jié)構(gòu)不易被破壞，與傳統(tǒng)提取方法相比，提取溶劑綠色、安全、無污染，具有一定的推廣和應(yīng)用價值。