張 健，張宿義，2，秦 輝，2，楊 艷，邱川峰，徐 瓊，康承霞，羅 杰，李德林，馬 蓉，王加彬

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000； 2.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000）

濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖為主要容器和基礎(chǔ)，窖泥中棲息著豐富而極其復(fù)雜的微生物菌系，其中主要的有益功能菌如己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌等[1]。正是這些有益功能菌的大量生長(zhǎng)、繁殖、代謝以及相互協(xié)調(diào)作用，才賦予了濃香型白酒的獨(dú)特香味，形成了以己酸乙酯為主體香的典型風(fēng)格[2]。窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。為了提高窖泥培養(yǎng)質(zhì)量，各大企業(yè)和專家學(xué)者對(duì)人工培養(yǎng)窖泥工作開(kāi)展了大量研究，并總結(jié)形成了以優(yōu)質(zhì)的原始窖泥為基礎(chǔ)，通過(guò)添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、老窖泥及各類功能菌，營(yíng)造良好的環(huán)境條件，使有益功能菌迅速生長(zhǎng)繁殖成優(yōu)勢(shì)菌群，從而培養(yǎng)出能夠達(dá)到老窖泥特性的人工窖泥[3]。人工窖泥培養(yǎng)過(guò)程中，添加的窖泥功能菌液主要有純種己酸菌培養(yǎng)液或復(fù)合功能菌液。本研究采用從100余年老窖泥中富集培養(yǎng)的復(fù)合功能菌液、分離純化的己酸菌液以及將二者按比例混合培養(yǎng)的復(fù)合菌液培養(yǎng)人工窖泥，根據(jù)窖泥培養(yǎng)過(guò)程的升溫、理化指標(biāo)、微生物變化以及窖泥感官評(píng)價(jià)，對(duì)窖泥培養(yǎng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)及分析。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料

黃泥、窖皮泥、老窖泥、麩皮、豆粕、曲粉、磷酸氫二鉀、黃水、尾水、窖泥功能菌液、純種己酸菌液。

1.1.2 主要儀器

LRH.250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），VD-850桌上式潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），DT1002電子天平（常熟市佳衡天平儀器有限公司），BST0001萬(wàn)用電爐（泰州市貝斯特電熱電器有限公司），YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），UV-1600PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），窖池?cái)?shù)顯溫度計(jì)（濟(jì)南雪納斯儀表有限公司），Agilent7890B型氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥功能菌液培養(yǎng)

從連續(xù)使用100余年窖底四周及中心點(diǎn)分別取樣后混合均勻，經(jīng)富集培養(yǎng)及多次擴(kuò)培篩選出產(chǎn)己酸能力強(qiáng)、菌體生長(zhǎng)旺盛且穩(wěn)定的窖泥復(fù)合功能菌液F1、F3，接種到窖泥時(shí)己酸菌數(shù)為2.6×108個(gè)/mL。分離純化己酸菌液S2、S4，接種到窖泥時(shí)菌數(shù)為3×108個(gè)/mL。窖泥復(fù)合功能菌液與純種己酸菌液按1∶1的比例混合擴(kuò)大培養(yǎng)菌液，接種到窖泥時(shí)菌數(shù)為2.9×108個(gè)/mL。

1.2.2 人工窖泥培養(yǎng)方案

（1）窖泥培養(yǎng)原料：黃泥、窖皮泥、老窖泥、麩皮、豆粕、曲粉、磷酸氫二鉀、黃水、尾水，按10%比例接入窖泥功能菌液，方案設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

（2）將地面清洗干凈，把黃泥均勻鋪在地面上（厚度20～30 cm），潑上一定量的黃水和尾水，然后按比例依次將麩皮、豆粕、曲粉、窖皮泥、老窖泥層層均勻鋪在黃泥上面，再根據(jù)需要潑上一定量的黃水和尾水，最后均勻?yàn)⑸狭姿釟涠洝?/p>

（3）使用耙梳和鐵鏟將原料和黃泥拌和均勻，窖泥功能菌液采用潑灑的方式，邊潑灑菌液邊用攪拌機(jī)拌和窖泥，并根據(jù)感官判斷添加尾水。

（4）待所有原輔料拌和均勻后且窖泥柔熟后，將窖泥收堆成長(zhǎng)條狀（2 m×2 m×0.75 m），用鐵鏟拍光，蓋上窖皮，四周用黃泥壓封，采用丟糟覆蓋保溫使其在30～40℃的環(huán)境下密封發(fā)酵90 d以上。

1.2.3 數(shù)據(jù)采集方法

每天定時(shí)定點(diǎn)檢測(cè)溫度，每15 d取樣測(cè)定理化指標(biāo)及微生物數(shù)量，窖泥培養(yǎng)結(jié)束，經(jīng)專家鑒定其質(zhì)量后應(yīng)用于生產(chǎn)。

1.3 檢測(cè)方法

己酸菌計(jì)數(shù)方法：血球計(jì)數(shù)板法。

溫度測(cè)定：窖池?cái)?shù)顯溫度計(jì)。

水分、pH值、氨態(tài)氮、有效磷測(cè)定：參照《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)》窖泥分析[4]。

有效鉀測(cè)定：參照《土壤農(nóng)化分析》土壤中鉀的測(cè)定[5]。

腐殖質(zhì)測(cè)定：參照《森林土壤腐殖質(zhì)組成的測(cè)定》[6]。

窖泥微生物計(jì)數(shù)方法：稀釋平板法。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥培養(yǎng)過(guò)程升溫情況

窖泥培養(yǎng)過(guò)程升溫情況見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，各方案中人工窖泥在培養(yǎng)過(guò)程中溫度變化呈現(xiàn)先上升，中間維持較高溫度，后期緩慢下降的規(guī)律。培養(yǎng)前期，窖泥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，加之殘存的氧氣，微生物快速生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生大量的熱量，導(dǎo)致窖泥溫度逐漸升高，在25 d左右達(dá)到頂溫，升溫幅度在10～16℃之間，在頂溫附近維持15 d左右，而后由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累，微生物的生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)逐漸變緩，窖泥溫度開(kāi)始緩慢下降。

表1 方案設(shè)計(jì)

對(duì)比各方案可以看出，方案5和方案6中混合培養(yǎng)菌液培養(yǎng)的窖泥升溫幅度和頂溫均高于其他方案，復(fù)合功能菌液與純種己酸菌液培養(yǎng)的窖泥升溫情況相近。

2.2 窖泥培養(yǎng)過(guò)程理化指標(biāo)變化情況

2.2.1 窖泥培養(yǎng)過(guò)程水分含量變化

水是細(xì)胞的重要組成部分，菌體所需營(yíng)養(yǎng)物必須呈水溶液狀態(tài)才能被吸收，各種微生物的生化活動(dòng)與窖泥含水量也有密切關(guān)系，水分過(guò)少時(shí)，微生物生長(zhǎng)、繁殖困難；水分過(guò)大時(shí)，窖泥過(guò)稀，搭窖困難，使用不便，人工窖泥必須濕潤(rùn)柔熟。所以，窖泥含水一般控制在35%～45%。窖泥培養(yǎng)過(guò)程水分含量變化見(jiàn)圖2。

由圖2可知，6個(gè)方案中，各方案起始水分含量均不超過(guò)37%，培養(yǎng)過(guò)程中窖泥水分含量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。在窖泥培養(yǎng)前45 d，窖泥水分含量明顯增加，這是由于培養(yǎng)前期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物利用添加的有機(jī)質(zhì)等進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖代謝，將有機(jī)質(zhì)分解成CO2、H2O、H2S、NH3等小分子物質(zhì)；后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗及溫度過(guò)高或過(guò)低等原因，微生物生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)減緩，水分緩慢增加。對(duì)比各方案得出，窖泥培養(yǎng)過(guò)程水分隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，增幅相差不大，培養(yǎng)90 d后水分含量均在40%左右。

2.2.2 窖泥培養(yǎng)過(guò)程pH值變化

pH值一方面影響微生物代謝過(guò)程中一些酶的活性，超出一定的范圍都會(huì)使微生物的生長(zhǎng)受到限制；另一方面會(huì)引起微生物細(xì)胞膜內(nèi)外電荷的變化，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[7]。己酸菌最適生長(zhǎng)初始pH值為7.0，在中性或中性偏酸的條件下菌體增殖較好。窖泥培養(yǎng)過(guò)程pH值變化見(jiàn)圖3。

圖1 窖泥培養(yǎng)過(guò)程溫度變化情況

圖2 窖泥培養(yǎng)過(guò)程水分含量變化情況

由圖3可知，各方案在窖泥培養(yǎng)前45 d，pH值呈下降趨勢(shì)，后期pH值略有上升，后下降。主要由于前期營(yíng)養(yǎng)豐富，微生物進(jìn)行各種生化反應(yīng)產(chǎn)生多種有機(jī)酸。從整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程看，pH值降低，但下降幅度不大，培養(yǎng)終點(diǎn)pH值均在5.1左右。各方案之間表現(xiàn)出，兩種混合培養(yǎng)菌液培養(yǎng)的窖泥pH值降低較多，純種己酸菌液培養(yǎng)的窖泥pH值降低最少，可能是混合培養(yǎng)，微生物間協(xié)同作用增強(qiáng)，提高了功能菌的產(chǎn)酸能力，從而使pH值下降更多。

2.2.3 窖泥培養(yǎng)過(guò)程氨態(tài)氮含量變化

氨態(tài)氮是窖泥功能菌生長(zhǎng)、繁殖所需的主要氮源，除曲藥中本身含有一定量的氨態(tài)氮外，氨態(tài)氮是微生物分解有機(jī)質(zhì)而形成的。在使用的窖泥配方中，微生物主要可以分解豆粕、麩皮、曲藥中的有機(jī)質(zhì)而形成氨態(tài)氮。窖泥培養(yǎng)過(guò)程氨態(tài)氮含量變化見(jiàn)圖4。

如圖4所示，各方案窖泥中氨態(tài)氮含量總體表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢(shì)，培養(yǎng)結(jié)束后氨態(tài)氮含量在140 mg/100 g干土左右，較劉淼等[8]的研究，氨態(tài)氮含量偏低。主要是由于本文窖泥配方中所添加的氮源，均是有機(jī)氮源，除菌種培養(yǎng)基中添加少量硫酸銨以外，未單獨(dú)添加無(wú)機(jī)氮源。適宜的菌種添加量能保證有機(jī)質(zhì)的分解進(jìn)而作為氮源，減少無(wú)機(jī)氮源的添加，能有效防止窖泥板結(jié)等現(xiàn)象，同時(shí)避免氨態(tài)氮積累過(guò)多，導(dǎo)致窖泥出現(xiàn)泥臭。

上周（8月13日-8月17日），市場(chǎng)供貨略偏緊，氯化鉀報(bào)價(jià)高位堅(jiān)挺。8月20日中國(guó)氯化鉀批發(fā)價(jià)格指數(shù)（CKPI）為 2155.14點(diǎn)，環(huán)比上漲15.33點(diǎn)，漲幅為0.72%；同比上漲283.97點(diǎn)，漲幅為15.18%；比基期下跌1135.45點(diǎn)，跌幅為34.51%。

圖3 窖泥培養(yǎng)過(guò)程pH值變化情況

圖4 窖泥培養(yǎng)過(guò)程氨態(tài)氮含量變化情況

2.2.4 窖泥培養(yǎng)過(guò)程有效磷含量變化

有效磷是細(xì)胞核組成成分，也是微生物生長(zhǎng)、繁殖的必需物質(zhì)，因此，磷是窖泥功能菌增殖的必需物質(zhì)。同時(shí)，磷又是參與乙醇、乙酸化合成己酸這一發(fā)酵過(guò)程的重要物質(zhì)[9]。窖泥培養(yǎng)過(guò)程有效磷含量變化見(jiàn)圖5。

如圖5所示，各方案中有效磷均呈現(xiàn)出逐漸減少的趨勢(shì)，且在前15 d下降較多，后期有效磷含量上下波動(dòng)、變化較小。在人工培泥過(guò)程中，不宜加過(guò)磷酸鈣和重過(guò)磷酸鈣，由于它們含有游離的酸性強(qiáng)的H3PO4、H2SO4，且Ca2+易與乳酸形成沉淀，造成窖泥板結(jié)退化，本實(shí)驗(yàn)方案添加磷酸氫二鉀作為磷和鉀的補(bǔ)充。磷、鉀一般在窖內(nèi)發(fā)酵中，從酒醅中得到補(bǔ)充，使含量越積越多，因此培養(yǎng)窖泥時(shí)滿足微生物生長(zhǎng)即可，不必過(guò)量添加，否則會(huì)因無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高而造成窖泥的板結(jié)，從而嚴(yán)重影響窖泥微生物的活動(dòng)，致使窖泥退化。

2.2.5 窖泥培養(yǎng)過(guò)程有效鉀含量變化

窖泥培養(yǎng)過(guò)程有效鉀含量變化見(jiàn)圖6。

土壤中有效鉀主要為水溶性鉀和代換性鉀，它是酵母、霉菌、細(xì)菌等微生物所需的無(wú)機(jī)鹽類。雖然微生物對(duì)無(wú)機(jī)鹽需求量較少，但缺少鉀是不行的。如圖6所示，各方案中有效鉀含量在發(fā)酵過(guò)程中上下波動(dòng)，總量基本維持不變。

2.2.6 窖泥培養(yǎng)過(guò)程腐殖質(zhì)含量變化

窖泥中的腐殖質(zhì)部分是在微生物酶的作用下形成的小分子化合物和微生物代謝產(chǎn)物的合成物，部分是由其他有機(jī)物腐殖化的過(guò)程形成[9]。它是窖泥水分和養(yǎng)料的貯存器，可以為窖泥微生物提供充足的水分和養(yǎng)分，具有保持窖泥營(yíng)養(yǎng)，調(diào)節(jié)窖泥酸度，緩解乳酸鈣、乳酸鐵的生成，避免窖泥的板結(jié)退化等重要作用。使用時(shí)要防止因腐殖質(zhì)過(guò)量而帶來(lái)的惡臭。窖泥培養(yǎng)過(guò)程腐殖質(zhì)含量變化見(jiàn)圖7。如圖7所示，各方案中腐殖質(zhì)均呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，表明被窖泥微生物利用，但總體下降幅度不大；兩種混合培養(yǎng)菌液培養(yǎng)的窖泥腐殖質(zhì)含量下降最少。

圖5 窖泥培養(yǎng)過(guò)程有效磷含量變化情況

圖6 窖泥培養(yǎng)過(guò)程有效鉀含量變化情況

圖7 窖泥培養(yǎng)過(guò)程腐殖質(zhì)含量變化情況

2.3 窖泥培養(yǎng)過(guò)程微生物數(shù)量變化情況

2.3.1 窖泥中細(xì)菌總數(shù)變化

窖泥中細(xì)菌總數(shù)變化見(jiàn)圖8。

由圖8可知，窖泥培養(yǎng)前15 d，由于窖泥中添加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，存在部分氧氣，且環(huán)境條件優(yōu)越，方案1、方案3、方案5、方案6窖泥中細(xì)菌數(shù)量均有明顯增加；15～50 d，氧氣逐漸被消耗，窖泥溫度較高，細(xì)菌數(shù)量緩慢增加。后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量被消耗，所以部分細(xì)菌開(kāi)始死亡，有些細(xì)菌形成芽孢桿菌以適應(yīng)環(huán)境變化，最終細(xì)菌數(shù)量達(dá)到平衡狀態(tài)。而方案2、方案4窖泥中細(xì)菌數(shù)量整體變化幅度不大，主要原因是兩種方案窖泥培養(yǎng)添加的菌液為經(jīng)過(guò)分離純化的純種己酸菌液，雖然配方中添加老窖泥及窖皮泥中有其余窖泥功能菌存在，但數(shù)量較少。而其余方案中，所添加的復(fù)合窖泥功能菌液及混合培養(yǎng)菌液均較大程度地保留了窖泥中窖泥功能菌的多樣性，且部分菌種之間存在互利共生的關(guān)系，使其對(duì)環(huán)境有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。

2.3.2 窖泥中芽孢桿菌變化

在窖泥中，芽孢桿菌是濃香型白酒生產(chǎn)的主要釀酒功能微生物。芽孢桿菌對(duì)己酸的產(chǎn)生起到非常重要的作用，正是它們使?jié)庀阈桶拙凭哂衅洫?dú)特的風(fēng)格和香味。窖泥中芽孢桿菌變化見(jiàn)圖9。

由圖9可以看出，6個(gè)方案中，窖泥培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌數(shù)量總體變化均呈先增加后減少的趨勢(shì)；在發(fā)酵進(jìn)行到30 d時(shí)，方案1、方案3窖泥中芽孢桿菌數(shù)量超過(guò)其他幾種方案，達(dá)到最大值，隨后呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)；而方案2、方案4、方案5、方案6窖泥均在發(fā)酵45 d時(shí)，芽孢桿菌數(shù)量達(dá)到最大值。此后，方案5、方案6窖泥中芽孢桿菌數(shù)量高于其他幾種方案。方案1、方案3芽孢桿菌數(shù)量峰值高于其他方案且達(dá)到峰值的時(shí)間更短。分析原因可能是，通過(guò)富集培養(yǎng)的復(fù)合功能菌液菌群更豐富，在菌群的協(xié)同作用下環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)。

圖8 窖泥培養(yǎng)過(guò)程細(xì)菌總數(shù)變化情況

圖9 窖泥培養(yǎng)過(guò)程芽孢桿菌變化情況

2.3.3 窖泥中酵母菌數(shù)變化

窖泥中酵母菌數(shù)變化見(jiàn)圖10。

由圖10可看出，各方案在發(fā)酵前15 d，酵母菌數(shù)量均有所下降，在后期培養(yǎng)過(guò)程基本呈現(xiàn)出增加、減少交替出現(xiàn)的趨勢(shì)?？傮w來(lái)看，方案2、方案4窖泥中酵母菌數(shù)總體變化不大，其他方案窖泥中酵母菌數(shù)變化明顯，培養(yǎng)結(jié)束后，酵母菌數(shù)量明顯增加。

2.3.4 窖泥中霉菌總數(shù)變化

窖泥中霉菌總數(shù)變化見(jiàn)圖11。

由圖11可看出，方案2、方案4窖泥中霉菌數(shù)總體變化不大，其余4種方案窖泥在發(fā)酵前15 d，霉菌數(shù)量大幅下降，這同任道群等[10]研究的霉菌前期變化規(guī)律一致，培養(yǎng)75 d后有所增加。

在窖泥培養(yǎng)過(guò)程中，微生物總體呈現(xiàn)態(tài)勢(shì)為細(xì)菌總數(shù)＞芽孢桿菌＞霉菌＞酵母。通過(guò)對(duì)比可以大致得出，以富集培養(yǎng)的復(fù)合功能菌液和混合培養(yǎng)的菌液接種培養(yǎng)的窖泥中，細(xì)菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母數(shù)量都高于純種己酸菌液，且混合培養(yǎng)的各種微生物數(shù)量又高于富集培養(yǎng)的復(fù)合菌液，主要是因?yàn)椋焊患囵B(yǎng)液和混合培養(yǎng)菌液生物多樣性高，菌群更豐富，各種微生物間相互促進(jìn)、互利共生；同時(shí)，純菌種繁殖代謝能力強(qiáng)，菌株強(qiáng)壯，畸形率低，能較穩(wěn)定的保持生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

2.4 窖泥感官評(píng)價(jià)

由于各廠家窖泥培養(yǎng)過(guò)程中添加的窖泥功能菌液比例、各種配料的種類及比例不同，導(dǎo)致各理化及微生物指標(biāo)差異較大，亦沒(méi)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)窖泥質(zhì)量等級(jí)進(jìn)行劃分，因此窖泥質(zhì)量以感官鑒定為主。在窖泥90 d發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)不同窖泥進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖10 窖泥培養(yǎng)過(guò)程酵母菌變化情況

圖11 窖泥培養(yǎng)過(guò)程霉菌總數(shù)變化情況

表2 不同方案人工窖泥的感官鑒定

從各方案窖泥感官鑒定看來(lái)，方案2、方案4窖泥氣味比較單一、缺少窖香味，而各方案窖泥老熟程度差異不大。

3 總結(jié)

添加不同窖泥功能菌液培養(yǎng)人工窖泥，其發(fā)酵正常，升溫幅度及維持頂溫的時(shí)間相差不大；各方案理化指標(biāo)變化規(guī)律趨于一致，數(shù)量上有一定差異：均表現(xiàn)出窖泥水分、氨態(tài)氮含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增加，窖泥pH值、有效磷、腐殖質(zhì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減少，窖泥中有效鉀含量變化不大。各方案微生物數(shù)量呈現(xiàn)出細(xì)菌總數(shù)、芽孢桿菌先增加后減少；酵母菌及霉菌由于其數(shù)量較少，規(guī)律性不強(qiáng)。對(duì)比各方案微生物可以得出，添加復(fù)合功能菌液和混合培養(yǎng)菌液的4種窖泥培養(yǎng)方案，在各微生物數(shù)量上優(yōu)于添加純種己酸菌液；且此4種方案的感官評(píng)價(jià)結(jié)果亦較優(yōu)。后期，將6種方案培養(yǎng)的窖泥應(yīng)用于同一班組不同窖池，在相同工藝參數(shù)的情況下，跟蹤幾排產(chǎn)酒情況，綜合評(píng)價(jià)窖泥質(zhì)量。