徐 濱，柳慶坤，徐學(xué)珊*

（1. 泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000；2. 泰安市中心醫(yī)院， 山東 泰安 271000）

常用的食品色素包括兩類：天然色素和人工合成著色劑。天然色素主要由植物組織中提取，對人體無毒性[1]。人工合成色素多以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)一系列有機(jī)合成反應(yīng)而成，相對于天然色素，它色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、著色力強(qiáng)、價格低廉，成為食品行業(yè)常用的添加劑之一[2-3]。若過量添加或長期食用人工合成著色劑對人體健康會造成嚴(yán)重危害，嚴(yán)重者甚至?xí)掳?、致畸[4]。

目前，測定人工合成著色劑的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2-6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[7]。本文采用HPLC-紫外檢測器，同時測定檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅8種人工合成著色劑。優(yōu)化前處理方法，減少干擾物對實驗結(jié)果的影響，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于大批量、多批次熟肉制品中人工合成著色劑的檢測。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（SPD-20AB型泵、SPD-20A型紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱、LC Solution液相色譜數(shù)據(jù)工作站，日本島津）；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫）；SHIMADZU Wondasil C18-WR色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本島津）；AB104-S電子分析天平（瑞士，Mettler Toledo）；TG16-WS離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司）；DPS-20均質(zhì)器（美國PRO）；KQ-600DE型超聲儀（昆山超聲儀器公司）；Essential超純水儀（密理博中國）；G3垂容漏斗（天津玻璃儀器廠）；50 ml刻度離心管（美國康寧）；絞肉機(jī)（九陽公司）。

1.2 材料

100～200目聚酰胺粉（浙江臺州路橋四甲生化塑料廠）；0.45 μm微孔濾膜（上海安譜公司）；甲醇（色譜純，賽默飛世爾公司）；乙酸銨（色譜純，賽默飛世爾公司）；無水乙醇（分析純，天津百世）；氨水（分析純，國藥集團(tuán)）；檸檬酸（分析純，天津永大）；甲酸（分析純，成都科龍）；石油醚（分析純，國藥集團(tuán)）；亞鐵氰化鉀（分析純，天津永大）；乙酸鋅（分析純，天津永大）；純化水。標(biāo)準(zhǔn)品儲備液見表1。

表1 8種色素對照品儲備液

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別取表1中標(biāo)準(zhǔn)儲備液各適量，用水稀釋成濃度分別為 1，5，10，15，20，25 μg/ml的系列混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取熟肉樣品，經(jīng)絞肉機(jī)充分?jǐn)噭?，取約2.0 g樣品，精密稱定，置入50 ml刻度離心管，加溫水約30 ml，均質(zhì)1 min，超聲20 min。加入5 ml亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）和5 ml乙酸鋅溶液（183 g/L）溶液，溫水定容至50 ml，充分混勻，靜置10 min。5000 r/min高速離心10 min，取出上層液，加溫水多次提取至無色，合并上層液于分液漏斗中，加50 ml石油醚萃取3次，取下層液加檸檬酸溶液（0.2 g/ml）調(diào)節(jié)pH 4，作為試樣溶液。取1 g聚酰胺粉加少許水調(diào)成粥狀，倒入試樣溶液，快速攪拌，如果溶液還有顏色再添加少許聚酰胺粉，至溶液近無色，用G3垂熔漏斗抽濾，用 pH 4（水加檸檬酸溶液調(diào)pH 4）的水洗3次，每次20 ml，用甲醇-甲酸混合溶液（6:4）洗3次，每次10 ml，再用水洗至中性，用無水乙醇-氨水-水混合溶液（7:2:1）洗3次，每次5 ml，收集解吸液，加乙酸調(diào)節(jié)pH值至7，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容于5 ml，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-乙酸銨溶液（0.02 mol/L）為流動相，梯度洗脫，程序見表2；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣體積為10 μl；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm。取混合對照品溶液10 μl注入高效液相色譜儀，理論板數(shù)以檸檬黃的峰計算不低于7813，檸檬黃與新紅的分離度大于2?；旌蠈φ掌啡芤海舛葹?5 μg/ml）的色譜圖見圖1。

表2 流動相梯度洗脫程序

圖1 混合對照品溶液的色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍考察 在3.2項色譜條件下，取系列混合對照品溶液注入液相色譜儀，得到峰面積（Y）與濃度（X）間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表3。由表3可見各合成著色劑濃度與峰面積線性關(guān)系良好，線性范圍為1～25 μg/ml，相關(guān)系數(shù)r＞0.99994 。

表3 各合成著色劑保留時間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3.2 檢出限試驗 以3倍基線噪音的峰高相當(dāng)?shù)暮铣芍珓┑牧坑嬎銠z出限，檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅的檢出限分別為0.02，0.028，0.012，0.008，0.016，0.012，0.012，0.008 μg/ml。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取熟肉樣品，加入一定量的混合對照品溶液，制成模擬陽性樣品，進(jìn)樣6次，重復(fù)性良好，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗（n=6）

2.3.4 回收率試驗 取3種已知8種合成著色劑含量的不同熟肉制品各3份，每份2.000 g，分別加入8種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20，40，60 μg，按本法處理，進(jìn)行測定，計算加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見表5。RSD值在0.32%～2.12%之間，加標(biāo)回收率在83.0%～97.9%之間，符合食品檢驗要求。

表5 方法回收率試驗結(jié)果（n=3）

2.4 樣品測定

采用此測定方法對110批次的熟肉制品（包括香腸、烤鴨、燒雞、豬頭肉、風(fēng)干肉、肉罐頭等）進(jìn)行了檢測，部分熟肉制品中檢出了檸檬黃和日落黃，含量分別為3.225 mg/kg、5.165 mg/kg，陽性樣品圖譜見圖2。

圖2 陽性樣品溶液色譜圖

3 討論

3.1 樣品處理條件優(yōu)化

熟肉制品中含大量蛋白質(zhì)和脂肪，樣品處理中加入蛋白沉淀劑（亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液）去蛋白質(zhì)，用石油醚萃取脂肪，達(dá)到凈化效果，有效減少254 nm檢測波長處干擾峰的出現(xiàn)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 色譜柱的選擇

分別用SHIMADZU Wondasil C18-WR和Agilent ZORBAX SB-C18兩種C18柱對8種混合合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行相同條件的梯度洗脫，由于檸檬黃和新紅兩種合成著色劑的保留時間非常接近，SHIMADZU Wondasil C18-WR色譜柱不能將兩色譜峰徹底分開，合并重疊形成一個色譜峰。使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，8種合成著色劑分離效果良好，且出峰時間早，縮短了分析檢測時間。

本實驗方法采用梯度洗脫，在254 nm波長下同時測定8種合成著色劑，方法穩(wěn)定，線性范圍良好，靈敏度高，受雜質(zhì)峰的干擾較小，各峰之間分離度好，能滿足日常熟肉制品中人工合成著色劑的檢驗要求，具有重要的實際應(yīng)用價值。