李文嫻，王麗榮，王三虎*

(1.河南科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.長(zhǎng)垣職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校 農(nóng)學(xué)系，河南 長(zhǎng)垣 453400)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種重要的細(xì)菌性豬源病原體，可引起豬敗血癥、腦膜炎等癥狀。根據(jù)莢膜抗原的不同，豬鏈球菌可以分為35個(gè)血清型，根據(jù)毒力不同可被分為高度致病性、低致病性和非致病性。豬鏈球菌2型是致病性最強(qiáng)的豬鏈球菌，可從臨床患病的仔豬中分離獲得[1-3]。豬鏈球菌2型是一種重要的人獸共患病原菌[4-5]，Yanase等[6]從日本1名患有腦膜炎和化膿性腦室炎的肉類批發(fā)商的血液和腦脊液中分離到豬鏈球菌2型， Gomez-Torres等[7-8]報(bào)告了1例加拿大的豬鏈球菌人類疾病，分離的菌株是血清型2型，基因型上與北美豬中分離到的菌株相近。

豬鏈球菌病分布范圍廣，自1954年在英國首次報(bào)道以來，荷蘭、英國、法國、美國等國家均有報(bào)道。1958年，我國首次發(fā)現(xiàn)該病，20世紀(jì)70～80年代發(fā)病日趨嚴(yán)重，在許多地區(qū)呈地方性流行、大群爆發(fā)。1998年和2005年，我國曾2次爆發(fā)豬鏈球菌病，造成萬余頭豬死亡，52人死亡[9]。目前，我國多個(gè)地區(qū)不斷有人感染豬鏈球菌的報(bào)道，已嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和人類健康[10-12]。

本試驗(yàn)從河南不同規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)生敗血癥的仔豬中采集肝、脾、腎等臟器，采用涂片鏡檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)等方法對(duì)采集的病料進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

采集2009—2011年臨床發(fā)病豬的肝、脾、腎、肺、腦、關(guān)節(jié)液和皮下膿腫物樣品，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株及試驗(yàn)動(dòng)物

豬鏈球菌2型無毒株1330購自中國獸藥監(jiān)察所；無鏈球菌感染的仔豬由河南輝縣現(xiàn)代化養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.1.3 主要試劑

普通瓊脂平板、血瓊脂平板、血清肉湯培養(yǎng)基參照參考文獻(xiàn)[12]制備；生化試驗(yàn)所用試劑購自濟(jì)南根博生物有限公司；生化鑒定管、氨芐青霉素、阿莫西林、恩諾沙星、克林霉素等藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；LA Taq、dNTP、DNA Marker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 主要儀器

移液器購自德國Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備廠；高壓滅菌器購自北京勤誠盛達(dá)科學(xué)儀器有限公司；PCR儀購自美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)購自英國Syngene公司。

1.2 方法

1.2.1 病料鏡檢

在超凈工作臺(tái)里，采集發(fā)病豬的心血涂片及脾、肝、肺、淋巴結(jié)等組織臟器觸片或涂片，經(jīng)干燥、固定、革蘭染色、染色區(qū)域風(fēng)干后，在油鏡下觀察染色情況和形態(tài)特征。

1.2.2 豬鏈球菌的分離培養(yǎng)

將無菌采集的發(fā)病豬的臟器接種于血瓊脂平板上，室溫放置3～5 min，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)和變化趨勢(shì)。挑取疑似陽性的菌落，進(jìn)行染色鏡檢，觀察其是否形成短鏈排列的菌落形態(tài)。將鏡檢陽性的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)，最終經(jīng)染色鏡檢無雜菌的細(xì)菌保存，并利用平板表面涂布法記數(shù)菌落總數(shù)，稀釋至合適濃度備用。

1.2.3 PCR鑒定

依據(jù)GenBank中發(fā)表的StreptococcussuisGDH基因序列(AB246887.1)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)鑒定引物，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5′-CATGAAACAGAATTCCTCCAA GC-3′；下游引物：5′-GTATTGACCGTACATGTAAC CGA-3′。以分離菌株的基因組DNA作為模板，利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度約為500 bp。

1.2.4 生化特性分析

利用微量發(fā)酵管，將菌液接種于甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、肝糖、肌醇、木膠糖、硫化氫、蔗糖、VP等發(fā)酵管中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離株對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性。將分離株通過劃線、挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)。菌液利用生理鹽水進(jìn)行稀釋后，終濃度為1×105mL-1，將其接種在血瓊脂平板上(0.2 mL·L-1)。在培養(yǎng)基表面放置藥敏片，兩片之間的距離以1～2 cm為宜，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，分析分離株對(duì)各藥物的敏感性。

1.2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

選取健康仔豬20頭，隨機(jī)分成2組，每組10頭。試驗(yàn)組靜脈注射分離株菌液2 mL(接種量為6×107頭-1)，對(duì)照組靜脈注射等體積的生理鹽水。觀察并記錄動(dòng)物的臨床表現(xiàn)，及時(shí)解剖死亡豬并記錄病理變化，28 d后撲殺所有豬，剖檢并記錄。無菌采集死亡和剖檢的試驗(yàn)豬的心肌、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟進(jìn)行細(xì)菌分離，用PCR方法鑒定分離菌株，并判定分離株對(duì)試驗(yàn)豬的致病力。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏡檢結(jié)果

部分發(fā)病豬的臟器(如肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié))涂片后，可在顯微鏡下看到單個(gè)或多個(gè)圓形球菌排列(圖1)。

圖1 分離菌株的鏡檢情況(1 000×)

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

分離菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，可見中等大小的菌落，該菌落呈圓形、透明，且中央隆起、邊緣整齊，帶有溶血環(huán)。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行鏡檢，具有成對(duì)或短鏈狀的細(xì)菌形態(tài)。

2.3 PCR鑒定

以分離株基因組DNA為模板，應(yīng)用豬鏈球菌2型GDH基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)。將檢測(cè)陽性的分離株進(jìn)一步測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與豬鏈球菌2型的GDH基因序列的同源性達(dá)97%。

1～8分別為豬鏈球菌2型分離株；M為DL 2000 DNA Marker圖2 分離菌株的PCR鑒定結(jié)果

2.4 生化試驗(yàn)結(jié)果

被檢菌株的生化反應(yīng)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，8株分離株均符合豬鏈球菌2型的生化特性。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏性試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，分離的菌株對(duì)青霉素、阿莫西林、恩諾沙星高度敏感，對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、林可霉素耐藥。

表1 生化試驗(yàn)的結(jié)果

注： +表示陽性；-表示陰性。

表2 藥敏試驗(yàn)的結(jié)果

注：抑菌環(huán)直徑>20為高敏； 15～20為中敏；<15為耐藥。

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，試驗(yàn)豬體溫高、呼吸困難，分泌的鼻液呈漿液狀。試驗(yàn)豬死亡8頭，對(duì)照正常。剖檢死亡豬，可見肺、肝臟、心、脾各臟器出血，全身淋巴結(jié)水腫。在超凈工作臺(tái)上采集死亡豬和對(duì)照的心、肝等器官進(jìn)行細(xì)菌分離，試驗(yàn)組可檢測(cè)到鏈球菌的存在，對(duì)照組中未分離到細(xì)菌。

3 討論

豬鏈球菌是革蘭氏陽性兼性厭氧球菌，在35種血清型中，2型豬鏈球菌是一種流行的強(qiáng)毒株。

對(duì)豬鏈球菌2型的進(jìn)一步分子分析，包括基因組測(cè)序、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等，有助于了解其作用機(jī)制，并為畜牧生產(chǎn)提供依據(jù)。

抗生素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有非常重要的作用，有利于抑制動(dòng)物消化道內(nèi)有害細(xì)菌的增殖，減少不必要的營(yíng)養(yǎng)消耗，節(jié)約飼料，增強(qiáng)抗病力等。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性已成為全球的公共衛(wèi)生問題。謹(jǐn)慎使用抗菌素，對(duì)于保持廣譜抗菌劑的治療功效和減少耐藥型豬鏈球菌菌株的選擇至關(guān)重要。本研究采用紙片擴(kuò)散法對(duì)所分離的豬鏈球菌進(jìn)行了耐藥性研究，研究發(fā)現(xiàn)，分離株對(duì)豬場(chǎng)常用的抗菌藥物(如鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素等)產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，表明飼養(yǎng)過程中這些藥物的長(zhǎng)期使用已促使菌株產(chǎn)生了耐藥性。