于 蒙, 程澤星

(揚州大學(xué)附屬醫(yī)院, 江蘇 揚州, 225001)

美洲商陸屬商陸科多年生宿根草本，其含有商陸皂甙和商陸多糖，具有較強的免疫活性作用。研究[1-2]顯示，由美洲商陸植物根莖中分離、提純的堿性核糖體失活蛋白(PAP)對多種動植物病毒具有廣譜抗性，可通過抑制人體免疫缺陷病毒的復(fù)制而治療艾滋病。目前，有關(guān)美洲商陸藥理作用的研究較多，但在遺傳毒性方面的研究鮮有報道。本研究設(shè)計中國倉鼠肺細胞染色體致突變實驗研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗細胞為中國倉鼠肺細胞(CHL), 由中科院上海細胞庫提供。受試物為美洲商陸根(干燥)，橫切成薄片, FW 135型中草藥粉碎機粉碎，過150目篩。其粉末灰白色，氣微甜，含量99.00%, 經(jīng)浸出物測定和商陸皂苷甲(C42H66O16)含量測定合格后, 4 ℃保存?zhèn)溆肹3-4]。主要試劑包括絲裂霉素C(MMC)、環(huán)磷酰胺(CP)、四唑鹽(MTT)，購自Sigma公司; Dulbecco′s Modifed Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基，購自GIBCO公司; 多氯聯(lián)苯(Aroclor1254)購自百靈威科技有限公司; 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9的制備: 選擇健康雄性成年SD大鼠3只，體質(zhì)量200～220 g, 采用Aroclor1254作為誘導(dǎo)劑，溶于玉米油中，濃度為200 mg/mL, 按500 mg/kg無菌操作行腹腔注射。動物誘導(dǎo)后每天給予正常的飲食和飲水，誘導(dǎo)后第5天頸椎脫臼處死動物，處死前12 h停止飲食，正常飲水。

無菌條件下取出肝臟，按每克肝臟加入無菌的0.15 mol/L氯化鉀溶液(0 ℃) 3 mL, 組織勻漿器20 000轉(zhuǎn)/min混勻1 min制成肝勻漿，在4 ℃條件下，以9 000 g離心10 min, 取其上清液(S9)分裝于無菌塑料管中，每管1 mL, -80 ℃保存?zhèn)溆?。S9活力經(jīng)診斷性誘變劑鑒定符合實驗要求。

每10 mL 10%S9混合液由以下成分組成: DMEM不完全培養(yǎng)液6.0 mL, 1.65 mol/L氯化鉀溶液0.2 mL, 0.4 mol/L氯化鎂溶液0.2 mL, 0.05 mol/L葡萄糖-6-磷酸溶液1.0 mL, 0.025 mol/L輔酶Ⅱ(氧化型)溶液1.6 mL, 大鼠肝S91.0 mL。需用時無菌操作配制, 0 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗分組: 購買的CHL細胞置于CO2培養(yǎng)箱(5% CO2)中37 ℃孵育。收集對數(shù)生長期細胞，進行細胞生長半數(shù)抑制濃度(IC50)測定和染色體畸變試驗。通過細胞生長指標檢測美洲商陸對CHL細胞的毒性，依據(jù)IC50設(shè)定染色體畸變試驗高劑量組，同時設(shè)陽性對照組(直接誘變劑MMC和間接誘變劑CP)和陰性對照組[滅菌水和二甲基亞砜(DMSO)]。

1.3 IC50測定

1.3.1 劑量設(shè)計: 依據(jù)體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗國家標準(GB/T 21794-2008)染毒濃度劑量設(shè)計原則，將終濃度5 mg/mL設(shè)定為96孔板IC50測定的最高劑量，下設(shè)6個劑量組(2.5、1.0、0.2、0.04、0.008、0.001 6 mg/mL), 另設(shè)陰性對照組及陽性對照組，每個劑量組分為加入代謝活化系統(tǒng)(+S9)和不加入代謝活化系統(tǒng)(-S9) 2個系列，每個劑量組設(shè)5個平行孔。

1.3.2 IC50試驗方法: 倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，收集對數(shù)生長期細胞，用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液濃度至5×104～6×104/mL, 吸取細胞懸液接種于96孔板中，每孔200 μL, 每個濃度設(shè)5個平行孔(邊緣孔用PBS溶液填充), 5% CO2、37 ℃孵育16 h, 棄去舊的培養(yǎng)液。在不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下(-S9), 每孔加入不含10%小牛血清的培養(yǎng)液199 μL, 試驗組每孔依次加入受試物溶液1 μL, 陰性對照組每孔加溶劑(無菌水和DMSO)1 μL, 陽性對照組每孔加絲裂霉素C(0.4 mg/mL) 1 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸去舊培養(yǎng)液，每孔加入180 μL DMEM完全培養(yǎng)液和20 μL MTT溶液(5 mg/mL), 混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 終止培養(yǎng)。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS溶液洗細胞1次，每孔加入150 μL DMSO, 置搖床上低速振蕩10 min, 使藍紫色結(jié)晶充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀[吸光度(OD) 490 nm]檢測各孔的吸光值。見表1。

表1 美洲商陸對CHL細胞的細胞毒性實驗 n=5)

在加入代謝活化系統(tǒng)的條件下(+S9), 陽性對照為環(huán)磷酰胺(20 mg/mL), 每孔依次加入受試物溶液1 μL和10% S9混合液20 μL, 用不含10%小牛血清的培養(yǎng)液補足至200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去舊的培養(yǎng)液，每孔加入180 μL DMEM完全培養(yǎng)液和20 μL MTT溶液(5 mg/mL), 混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 終止培養(yǎng)。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS溶液洗細胞1次，每孔加入150 μL DMSO, 置搖床上低速振蕩10 min, 使藍紫色結(jié)晶充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀(OD 490 nm)檢測各孔的吸光值。見表2。

表2 美洲商陸對CHL細胞的細胞毒性實驗

1.4 染色體畸變試驗

1.4.1 劑量設(shè)計: 依據(jù)劑量設(shè)計原則，抑制50%CHL細胞生長的受試物濃度設(shè)為染色體畸變試驗的高劑量組(終濃度, 200 μg/mL), 下設(shè)4 個劑量組，另設(shè)溶劑對照組(無菌水和DMSO)和陽性對照組(直接誘變劑MMC和間接誘變劑CP)。

1.4.2 染毒方法與體積: 染毒方法按GB/T 21794-2008進行，在加入代謝活化系統(tǒng)(+S9)和不加入代謝活化系統(tǒng)(-S9)的條件下，給處在增殖期的CHL細胞染毒受試物，染毒時間6 h，并在開始染毒后24 h采樣。上述結(jié)果如均為陰性，則需要在不加入代謝活化系統(tǒng)(-S9)的條件下進行一次延長染毒時間至一個半正常細胞周期的試驗(染毒時間24 h), 每個劑量組設(shè)2個平行樣品。

1.4.3 不加入代謝活化系統(tǒng)條件下(-S9)細胞染毒試驗方法: 倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，收集對數(shù)生長期細胞，用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液濃度，使細胞濃度調(diào)至5×104～6×104/mL, 吸取細胞懸液接種到6孔板中，每孔依次加入細胞懸液2 mL和DMEM完全培養(yǎng)液8 mL, 每個濃度設(shè)2個平行孔, 5% CO2、37 ℃孵育24 h, 棄去舊的培養(yǎng)液，加入新的DMEM完全培養(yǎng)液10 mL, 5% CO2、37 ℃孵育24 h。細胞密度達80%～90%時，吸去6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入不含10%小牛血清的培養(yǎng)液9.98 mL, 試驗組每孔依次加入受試物溶液20 μL, 陰性對照組每孔加入溶劑(滅菌水和DMSO)20 μL, 陽性對照組每孔加入絲裂霉素C(1 mg/ml) 20 μL, 細胞分別染毒6、24 h后，吸去舊的培養(yǎng)液，用Hanks液洗細胞3次，加入10 mL DMEM完全培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于24 h內(nèi)收獲細胞。收獲細胞前4 h, 加入細胞分裂中期阻斷劑秋水仙素，終濃度為1 μg/mL。

1.4.4 加入代謝活化系統(tǒng)條件下(+S9)細胞染毒試驗方法: 倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，收集對數(shù)生長期細胞，用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液濃度，使細胞濃度調(diào)至5×104～6×104/mL, 吸取細胞懸液接種到6孔板中，每孔依次加入細胞懸液2 mL和DMEM完全培養(yǎng)液8 mL, 每個濃度設(shè)2個平行孔, 5% CO2、37 ℃孵育24 h, 棄去舊的培養(yǎng)液。加入新的DMEM培養(yǎng)液, 5% CO2、37 ℃孵育24 h, 細胞密度達80%～90%時，吸去6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入不含10%小牛血清的培養(yǎng)液8.98 mL和10% S9混合液1.0 mL。試驗組每孔依次加入受試物溶液20 μL; 陰性對照組每孔加入溶劑(滅菌水和DMSO)20 μL; 陽性對照組每孔加入環(huán)磷酰胺(50 mg/mL)20 μL。細胞染毒6 h, 結(jié)束后吸去舊的培養(yǎng)液，用Hanks液洗細胞3次，加入10 mL DMEM完全培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng), 24 h內(nèi)收獲細胞，收獲細胞前4 h, 加入細胞分裂中期阻斷劑秋水仙素，終濃度為1 μg/mL。

1.4.5 收集細胞: ① 棄去6孔板內(nèi)培養(yǎng)液, 0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞2～3 min, 待細胞變圓、間隙變大后吸去胰蛋白酶溶液，加5 mL DMEM完全培養(yǎng)液終止胰蛋白酶作用，用吸管輕輕吹打混勻。② 吸取細胞懸液入離心管中, 1 000轉(zhuǎn)/min離心7 min, 棄去上清液，加入37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L的氯化鉀溶液10 mL, 混勻, 37 ℃水浴低滲處理25 min。③ 預(yù)固定，細胞低滲處理后加入新鮮配制的固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1 mL, 混勻后靜置20 min。④ 固定, 1 000轉(zhuǎn)/min離心7 min, 棄上清，加固定液5 mL, 混勻后靜置20 min。重復(fù)上述步驟再固定一次。⑤ 棄去大部分上清液，留下0.3～0.5 mL, 充分打勻制成細胞混懸液，在潔凈的冷凍玻片上方15～20 cm處滴3～5滴細胞懸液于玻片上，輕吹細胞懸液擴散平鋪于玻片上，將玻片在酒精燈上微熱烘烤，自然晾干，每個樣本制片2 張。⑥ 自然晾干的涂片用Giemsa應(yīng)用液染色10 min, 蒸餾水沖洗，晾干，待檢。

1.5 閱片

采用雙盲法閱片。在低倍鏡下按順序?qū)ふ冶尘扒逦⒏鱾€染色體分散、互不重疊、長短收縮適中、兩條單體分開、清楚地顯示出著絲點位置的染色體區(qū)域，在油鏡下進行細胞中期染色體畸變分析。染色體畸變類型包括多倍體、斷片、交換、環(huán)狀染色體、微小體、內(nèi)復(fù)制、染色體碎裂、雙著絲點染色體等。讀片時應(yīng)記錄每一觀察細胞的染色體數(shù)目，對于畸變細胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標位置及畸變類型。2個平行樣品各計數(shù)100個中期相細胞，每個劑量組分別計數(shù)200個分散良好的中期分裂相細胞。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.7 結(jié)果評價

在相同的試驗條件下，陽性結(jié)果至少進行3次重復(fù)測試，陰性結(jié)果至少進行2次重復(fù)測試，才能對受試藥品作出最終評價判定。首先觀察陽性對照組和陰性對照組的試驗結(jié)果，要求陰性對照組的染色體畸變率應(yīng)在質(zhì)控范圍(≤5%), 并且陽性對照組的染色體畸變率與陰性對照組的染色體畸變率有顯著差異(P<0.01)。下例情況下可判定受試物在本試驗系統(tǒng)中具有致突變性: 染色體畸變細胞數(shù)的增加與濃度相關(guān)或含染色體畸變的細胞數(shù)的增加是可重復(fù)的。

2 結(jié) 果

半數(shù)抑制濃度是指藥物能將細胞生長、病毒復(fù)制等抑制50%所需的藥物濃度(IC50)[5-9], 本研究結(jié)果顯示，隨著美洲商陸對CHL細胞的染毒濃度逐漸降低, CHL細胞存活細胞數(shù)增多，表明美洲商陸染毒濃度的高低與CHL細胞存活細胞數(shù)呈負相關(guān)，見圖1、2。在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，給處在增殖期的CHL細胞染毒受試物，染毒時間6 h, 并在開始染毒后24 h收集細胞，檢測美洲商陸致CHL細胞染色體畸變數(shù)目和染色體畸變類型，結(jié)果陰性。依據(jù)GB/T 21794-2008國標試驗要求，在不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下進行一次延長染毒時間至一個半正常細胞周期的試驗(染毒時間24 h), 收集CHL細胞，鏡檢，染色體畸變試驗結(jié)果陰性。在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下細胞暴露于受試物, CHL細胞的5個劑量組染色體畸變率與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 未出現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系, 2次試驗結(jié)果一致。陽性對照組染色體畸變率顯著高于美洲商陸各劑量組和陰性對照組(P<0.01)。見表3、4、5。

3 討 論

根據(jù)國家藥典中美洲商陸的藥理學(xué)特性，利用細胞完整性和細胞生長(存活細胞計數(shù))指標來測定美洲商陸對CHL細胞的毒性。本研究結(jié)果表明，給處在增殖期的CHL細胞染毒，隨著受試物染毒, CHL細胞的濃度逐漸降低, CHL細胞存活數(shù)增高。在不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下(-S9), 陽性對照(絲裂霉素C, 2 μg/mL) OD值(0.70±0.06), IC50=84.78, 美洲商陸(0.2 mg/mL)OD值(0.41±0.04), IC50=49.94; 在加入代謝活化系統(tǒng)的條件下(+S9), 陽性對照(環(huán)磷酰胺, 100 μg/mL)OD值(0.70±0.03), IC50=85.21, 美洲商陸(0.2 mg/mL)OD值(0.41±0.02), IC50=49.96。表明不需要外源性代謝活化的陽性對照物絲裂霉素C和需要外源性代謝活化的陽性對照物環(huán)磷酰胺，對CHL細胞的毒性濃度設(shè)計合理，陽性試驗系統(tǒng)敏感。在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，美洲商陸濃度在0.2 mg/mL時對CHL細胞的毒性無顯著差異，存活細胞數(shù)一致。

表3 美洲商陸第1次染毒6 h對CHL細胞染色體畸變試驗結(jié)果

表4 美洲商陸第2次染毒6 h對CHL細胞染色體畸變試驗結(jié)果

表5 美洲商陸染毒24 h對CHL細胞染色體畸變試驗結(jié)果

CHL細胞是中國倉鼠胚胎肺成纖維細胞株，染色體眾數(shù)為(22±2)的二倍體細胞，其細胞周期約16 h, 克隆形成率約95%, 是目前運用較為廣泛的一株哺乳動物細胞。依據(jù)體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗方法(GB/T 21794-2008), 收集受試物各劑量組(200.0～1.6 μg/mL)、溶劑對照組(滅菌水和DMSO)、陽性對照組(直接誘變劑MMC和間接誘變劑CP)的中期分裂相細胞進行染色體畸變數(shù)和染色體畸變類型分析。溶劑對照組染色體結(jié)構(gòu)畸變細胞百分率在規(guī)定的質(zhì)控范圍內(nèi)(≤5%), 與相關(guān)文獻[10-12]報道一致。美洲商陸致CHL細胞的染色體畸變實驗表明，在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下, CHL細胞暴露于受試物6 h, CHL細胞生長正常。美洲商陸染色體畸變細胞數(shù)與溶劑對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 染色體畸變細胞數(shù)與陽性對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在不加入代謝活化系統(tǒng)(-S9)的條件下將染毒時間延長至24 h, 收集CHL中期分裂相細胞、鏡檢，顯示CHL細胞染色體畸變細胞數(shù)百分率與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), CHL細胞染色體畸變細胞數(shù)百分率與陽性對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[13-15]。

綜上所述，選用CHL細胞進行體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗符合臨床藥物毒理學(xué)試驗標準。在本實驗條件下，美洲商陸不誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體結(jié)構(gòu)畸變，本實驗研究對美洲商陸堿性核糖體失活蛋白基因水平上的研究有促進作用。