李興國，趙道洲，張 磊

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

激素性股骨頭壞死是臨床常見的致殘率較高的骨科疾患。隨著激素類藥物在臨床、食物中的廣泛應(yīng)用，激素性股骨頭壞死的相關(guān)報(bào)道屢見不鮮，且發(fā)病年齡趨于年輕化。激素性股骨頭壞死來院就診時大多已經(jīng)出現(xiàn)股骨頭及髖關(guān)節(jié)變形，不得不進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換［1］。當(dāng)前，激素性股骨頭壞死的防治已成為世界性的醫(yī)學(xué)課題。早診斷，積極保頭的治療可免于或者延遲人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)［2-3］。因此，國內(nèi)外學(xué)者用不同的方法建立SANFH模型，進(jìn)而從分子、基因等方面對發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究［4］。本研究復(fù)習(xí)文獻(xiàn)選擇常用且不同的3種造模方法：單純激素法、內(nèi)毒素加激素法和馬血清加激素法，建立不同的激素性股骨頭壞死模型，從影像學(xué)、組織病理學(xué)方面進(jìn)行研究，比較出典型的、接近臨床的兔激素性股骨頭壞死模型，并進(jìn)一步研究激素性股骨頭壞死的發(fā)病病因及發(fā)病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物 同齡、健康新西蘭大白兔48只，雌雄各半。新西蘭大白兔來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(甘)2010-0001。

1.2 主要試劑及儀器 大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS，美國Sigma公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字S10820320，規(guī)格：25 mg/瓶)；甲基強(qiáng)的松龍(MP，上海羅氏公司，批號：H20030727，規(guī)格：500 mg/ 瓶)；地塞米松磷酸鈉注射液(DXM，天津藥業(yè)焦作有限公司，國藥準(zhǔn)字H41020036，規(guī)格：10 mL/支)；馬血清(上海卓康生物科技有限公司，國藥準(zhǔn)字S10910131，規(guī)格：200mL/瓶)；慶大霉素［天津藥業(yè)焦作有限公司，國藥準(zhǔn)字H41020089，規(guī)格：20 mL(80萬 U)/支］；戊巴比妥鈉(上海試劑二廠，批號：810923)。實(shí)驗(yàn)室為蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及飼養(yǎng) 48只同齡健康新西蘭大白兔于蘭州軍區(qū)動物飼養(yǎng)科飼養(yǎng)。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重，以體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為 4組：A組(空白組)、B組(單純激素組)、C組(內(nèi)毒素加激素組)、D組(馬血清加激素組)。各組雌雄不限，體質(zhì)量2.2～3.0 kg，均在同一條件下室內(nèi)單籠飼養(yǎng)，進(jìn)食普通飼料，溫度(20±2)℃，濕度50%。實(shí)驗(yàn)過程中動物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見［5］。

1.3.2 造模 A組(空白組)與其他組同時間點(diǎn)注射等量生理鹽水；B組(單純激素組)同時間點(diǎn)兔雙側(cè)臀肌注射地塞米松(DXM)2.5 mg/(kg·d)，連續(xù)注射9周；C組(內(nèi)毒素加激素組)第1天于兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS)20 μg/kg，間隔24小時再次注射LPS，在第2次注射完大腸桿菌內(nèi)毒素后隨即肌肉注射甲基強(qiáng)的松龍20 mg/(kg·d)，共3次，間隔24小時。每次注射前均重新稱重后計(jì)算劑量。D組(馬血清加激素組)兔耳緣靜脈注入馬血清共10 mL/(kg·次)，共2次，間隔2周。第2次馬血清注射后2周，再連續(xù)3天臀部注射甲基強(qiáng)的松龍 40 mg/(kg·d)［6］。所有動物臀部肌注慶大霉素每天8萬U，連續(xù)1周，以預(yù)防感染。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般行為學(xué) 一般形為學(xué)觀察包括動物活動度、體質(zhì)量、尿量、精神、毛發(fā)光澤度等。后期病理切片取材時觀察股骨頭外觀。

1.4.2 X線檢查 D組兔最后1次注射完甲基強(qiáng)的松龍次日計(jì)為所有動物實(shí)驗(yàn)開始第1日。第3、6、9周各組兔子以3%戊巴比妥鈉12 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉后拍攝X線片，主要觀察兔股骨頭X線平片變化情況，對X線平片進(jìn)行定性評價(jià)：包括股骨頭形態(tài)、密度、骨小梁結(jié)構(gòu)及骨皮質(zhì)連續(xù)性等。

1.4.3 組織病理學(xué) 將第3、6、9周各組隨機(jī)抓取的2只兔子以空氣栓塞法處死后，手術(shù)取出雙側(cè)股骨頭，由基底部沿正中冠狀面將股骨頭劈開，立即4%多聚甲醛液固定48小時，10%乙胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣1～2周，流動水沖洗24小時，系列酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 μm層厚切片，行HE染色。光鏡下觀察骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔脂肪細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，各組間效應(yīng)差異應(yīng)用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué) A組：正常飲食，體質(zhì)量漸增。B、C、D組動物注射藥物后出現(xiàn)精神萎靡，活動及飲食飲水次數(shù)減少，反應(yīng)淡漠，并出現(xiàn)畏寒喜蜷縮，雙耳下垂，部分動物流涕，部分出現(xiàn)腹瀉，動物于末次注射后3周明顯消瘦，體質(zhì)量減輕。A組動物于末次注射后4周體質(zhì)量增加，注射中有1只動物死亡。B組注射中有3只動物死亡；C組末次注射后10天內(nèi)有5只動物死亡，D組末次注射后10天內(nèi)有4只動物死亡。實(shí)際進(jìn)入統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)動物為A組11只，B組9只，C組7只，D組8只。4組新西蘭大白兔造模前及造模后體質(zhì)量比較結(jié)果見表1。

表1 各組動物實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量比較(±s) kg

表1 各組動物實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量比較(±s) kg

注：△表示與空白組比較，P＜0.01；▲表示與單純激素組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)后空白組(A) 11 2.24±0.83 2.55±0.81單純激素組(B) 9 2.26±0.94 1.82±0.74△內(nèi)毒素加激素組(C) 7 2.23±0.68 1.81±1.01△▲馬血清加激素組(D) 8 2.27±0.89 1.79±0.91△▲

由表1可見，1)實(shí)驗(yàn)前各組間兔體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明分組時遵守組間均衡一致的原則；2)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，空白組兔體質(zhì)量明顯增加，與其他3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，證明激素對兔體質(zhì)量有較大影響；3)C、D組與B組比較，結(jié)果表明：內(nèi)毒素和馬血清組對兔體質(zhì)量影響與單純激素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；4)C、D 2組間比較毒素和馬血清對兔體質(zhì)量影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2.2 X線檢查 各組兔子于第3、6、9周以3%戊巴比妥鈉12 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉后拍攝X線片。A組：雙側(cè)髖關(guān)節(jié)間隙正常，無關(guān)節(jié)面塌陷等情況，骨小梁清晰可見，骨質(zhì)正常，無骨質(zhì)疏松等異常表現(xiàn)(見圖1)。B組：第9周時關(guān)節(jié)間隙稍狹窄，骨質(zhì)輕度疏松(見圖2)。C組：第6周時關(guān)節(jié)間隙稍狹窄，骨質(zhì)疏松明顯(見圖3)；第9周時關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，骨質(zhì)疏松加重，并伴有輕度骨小梁模糊不清(見圖4)。D組：第6周時關(guān)節(jié)間隙狹窄，骨質(zhì)疏松明顯，并伴有輕度骨小梁模糊不清(見圖5)。第9周時關(guān)節(jié)間隙狹窄更加明顯，骨質(zhì)疏松加重，可見股骨頭模糊不清(見圖6)。

圖1 A組第9周時的正常X線片

圖2 B組第9周時X線片

圖3 C組第6周時X線片

圖4 C組第9周時X線片

圖5 D組第6周時X線片

圖6 D組第9周時X線片

2.3 病理學(xué)檢查結(jié)果 第3、6、9周時手術(shù)取出各組動物股骨，于股骨頭基底部將股骨頭分離，沿正中冠狀面將股骨頭劈開，立即4%多聚甲醛液固定48小時，10%EDTA脫鈣1～2周，系列酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 μm層厚切片，行蘇木精-伊紅染色(HE)染色。光鏡下觀察骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔脂肪細(xì)胞的變化。A組：股骨頭軟骨厚度均勻一致，軟骨細(xì)胞排列整齊；骨小梁結(jié)構(gòu)完整、粗壯，排列規(guī)則整齊，致密飽滿，骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞形態(tài)正常，骨細(xì)胞清晰可見，核較大、位于中央，骨髓腔增生活躍，造血細(xì)胞豐富，骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞形態(tài)正常(圖7)。B組：第3、6周所取標(biāo)本同A組，第9周股骨頭形態(tài)基本正常股骨頭軟骨稍薄(圖8)。C組：第3周取材切片同A組。在第6、9周于股骨頭干垢端即股骨頭與股骨頸交界的應(yīng)力區(qū)可見部分骨小梁斷裂，有軟骨破壞，無股骨頭表面塌陷等情況，第9周脂肪變性加重及壞死骨組織擴(kuò)大(圖9)。D組：第3周取材同A組。在第6、9周見股骨頭形態(tài)完整，股骨頭軟骨面有輕度毛糙，稍欠光滑，略呈灰白色。無軟骨缺損及股骨頭表面塌陷等情況(圖10)。

圖7 A組病理學(xué)檢查結(jié)果(HE×40)

圖8 B組病理學(xué)檢查結(jié)果(HE×40)

圖9 C組病理學(xué)檢查結(jié)果

圖10 D組病理學(xué)檢查結(jié)果(HE×10)

3 結(jié)論

經(jīng)過激素性股骨頭壞死3種模型方法的比較分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素加激素組和馬血清加激素組兩種方法均成功實(shí)現(xiàn)了造模。其中依據(jù)病理切片通過骨組織形態(tài)比較［7］發(fā)現(xiàn)以內(nèi)毒素加激素組造模出現(xiàn)壞死征像較早，馬血清加激素組次之，單純激素未獲得成功。

從實(shí)驗(yàn)周期看，馬血清加甲強(qiáng)龍組造模前需要注射2次馬血清，中間間隔2周，再持續(xù)注射甲基強(qiáng)的松龍3次，造模前準(zhǔn)備總計(jì)17天。內(nèi)毒素加甲基強(qiáng)的松龍組造模前準(zhǔn)備總計(jì)7天。造模6周后內(nèi)毒素加激素組56%、血清加激素組67%出現(xiàn)股骨頭壞死，而動物死亡率分別為42%(5/12)，33.33%(4/12)。Matsui等［8］模型中未提及動物死亡率，Kabata等［9］模型中動物死亡率為40%(8/20)。不考慮該實(shí)驗(yàn)動物的種群膽小怕驚嚇致死等個體差異因素［10］，動物死亡率偏高，與其他報(bào)道一致。實(shí)驗(yàn)兔子來源廣泛，易于飼養(yǎng)和管理，兔子壽命相對較長可做長期藥理藥物實(shí)驗(yàn)，重復(fù)性高。

如何增加兔模型下肢負(fù)重［11］，或者增加兔髖關(guān)節(jié)機(jī)械壓力，加速造模，提高造模成功率，為后期實(shí)驗(yàn)研究提供保障。股骨頭壞死的生物力學(xué)影響因素越來越受到人們的重視。因此基于動物模型，結(jié)合激素模仿人體生物力學(xué)的研究顯得十分必要。在今后研究中可嘗試運(yùn)用小劑量低頻率，大劑量低頻率等方法以降低成本，節(jié)省資金和人力資源。

本研究發(fā)現(xiàn)第3、6周均見股骨頭形態(tài)光滑完整，股骨頭表面軟骨乳白色，無軟骨缺損及股骨頭表面塌陷等，情況同空白組。第9周股骨頭形態(tài)基本光滑完整，股骨頭軟骨面色澤稍暗。股骨頭病理切片檢測示：第3、6周所取標(biāo)本同空白組。第9周股骨頭形態(tài)基本正常，股骨頭軟骨稍薄。在DR拍片檢查中第3、6周同空白組，第9周時關(guān)節(jié)間隙稍有狹窄，骨質(zhì)輕度疏松。單純激素組未能誘導(dǎo)出激素性股骨頭壞死模型，部分學(xué)者認(rèn)為采用其他方法聯(lián)合造模可能與單純激素造模在調(diào)節(jié)因子和酶類的蛋白表達(dá)等機(jī)制方面有所不同，有待進(jìn)一步研究。

本研究中馬血清加甲強(qiáng)龍組、內(nèi)毒素加甲強(qiáng)龍組在第9周不論是股骨頭大體標(biāo)本觀測還是股骨頭病理切片檢測以及DR拍片檢查均符合激素性股骨頭壞死的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時顯示內(nèi)毒素加激素組在血液系統(tǒng)檢查、病理切片檢查方面早于馬血清加激素組，但部分指標(biāo)2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。內(nèi)毒素加激素組和馬血清加激素組均在6到9周出現(xiàn)了不同程度的股骨頭壞死征象，證明2組造?？煽?，可為藥物試驗(yàn)提供良好的平臺。