戴 穎 陳薇敏 徐姝琪 陳建清 胡良凱 徐選福 梁立維

腸纖維化及狹窄是多種慢性腸病比較棘手的并發(fā)癥，目前臨床上最常見的是由克羅恩病繼發(fā)的腸纖維化和腸狹窄。超過1/3的克羅恩病患者一生至少需要接受一次腸道手術(shù)，而70%纖維化狹窄表型的患者在疾病進展10年內(nèi)需要行腸管部分切除，手術(shù)1年后70% ～ 90%的患者吻合口狹窄復(fù)發(fā)且超過50%的患者會形成新的狹窄的[1]。流行病學數(shù)據(jù)顯示，炎癥性腸病的患病率和病死率在全球各個地區(qū)均呈升高趨勢，且患病年齡年輕化，但男、女患病率沒有顯著差異[2-3]。青蒿素是1972年我國科研人員首次從菊科植物黃花蒿中分離得到的抗瘧疾的有效單體，其衍生物包括二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯，均含有過氧橋結(jié)構(gòu)，屬于新型倍半萜內(nèi)酯化合物。近年來的相關(guān)研究證實，青蒿素具有抗瘧疾、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種重要藥理作用[4]。青蒿素衍生物有抗肝纖維化、肺纖維化及阻止膠原在肝、肺組織中沉積的報道[5-6]，但幾乎沒有其對于腸道纖維化是否有作用的相關(guān)報道。本實驗旨在探討蒿甲醚對硫酸葡聚糖 (dextran sulfate sodium, DSS)誘導的小鼠結(jié)腸炎腸纖維化的作用及機制，為腸纖維化的治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、動物與藥品

1. 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠44只，SPF級，6 ～ 8周齡，體重20 ～ 25 g(上海實驗動物中心)。

2. 藥品

蒿甲醚(上海西寶生物)、硫酸葡聚糖5000(上海西寶生物)、地塞米松注射液(馬鞍山豐原制藥)。

二、實驗方法

1. 動物分組

將44只小鼠隨機分為4組，其中正常對照組8只，另三組每組12只，分別為模型組、地塞米松組(治療對照組)、蒿甲醚組。

2. 造模及治療

正常對照組小鼠始終飲用一般蒸餾水，另三組用DSS與蒸餾水配成3%濃度讓小鼠自由飲用5 d，然后飲用普通水7 d，以此作為一個周期，共持續(xù)4個周期。從第3個周期開始，每天分別用橄欖油、地塞米松、蒿甲醚給小鼠灌腸，至第4周期結(jié)束。期間觀察記錄小鼠的臨床表現(xiàn)、大便性狀、體重、糞隱血情況。根據(jù)Murano等[7]制定的標準行DAI評分。

3. 標本采集

4個周期實驗結(jié)束后，采用心臟穿刺取血獲得血清樣本，整個結(jié)腸(從肛門至回盲瓣)即刻取樣、記錄長度、重量[8]；觀察結(jié)腸大體形態(tài)損傷，并參考Butzner等[9]評分方法進行評分。常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，參考王皓等[10]的評分方法進行組織學評分。進行Masson膠原三色染色，并通過圖像分析，取任意3個視野的膠原面積比值，計算平均值，進行膠原面積比值比較。取病變最嚴重的2處結(jié)腸組織制成組織勻漿備用。

4. 實驗儀器與試劑

Thermo Scientific HERA cell CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo Scientific Multiskan Spectrum酶標儀，小鼠CTGF Elisa試劑盒購自上海復(fù)申生物科技有限公司，小鼠pⅢ前膠原Elisa試劑盒購自上海復(fù)申生物科技有限公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒購自Takara公司，SYBR Premix Ex Taq購自Takara公司，Real time PCR儀(Roche Lightcycle 480)。

5. RT-PCR檢測結(jié)腸組織轉(zhuǎn)化生長因子1(transforming growth factor-beta1, TGF-β1)mRNA表達

取70 mg組織樣本按Tfizol試劑說明書抽提反應(yīng)總RNA。反轉(zhuǎn)錄步驟按照試劑盒說明書進行。將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行PCR反應(yīng)。TGF-β1上游引物：CTCCCGTGGCTTCTAGTGC；下游引物：GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括SYBR Premix Ex Taq，15 μL ；PCR Forward Primer(10 μM)，0.5 μL；PCR Reverse Primer(10 μM)，0.5 μL；DNA模板，0.5 μL；dH2O(滅菌蒸餾水)，8.5 μL。用漩渦振蕩器將管中溶液徹底混合均勻，短暫低速離心。點樣后置于Realtime PCR儀上進行PCR反應(yīng)：反應(yīng)條件：95 ℃，5 min，40個PCR循環(huán)(95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；79 ℃，20 s [收集熒光])。擴增反應(yīng)結(jié)束后，為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。跑下述程序(95 ℃，2 min；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；99 ℃，15 s，并從72 ℃緩慢加熱到99 ℃ 8 min)。各樣品的目的mRNA和內(nèi)參(GAPDH)分別進行Realtime PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析。

6. Elisa檢測血清結(jié)締組織生長因子(cornective tissue growth factor, CTGF)和Ⅲ型前膠原(procollagen type Ⅲ, PCⅢ)

①實驗前將試劑盒及待測標本放置室溫平衡30min；②將標準品50 μL依次加入孔中，并做好標記；③在待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL ，然后再加待測樣品10 μL (樣品最終稀釋度為5倍)；④在標準品和樣品孔中分別加入50 μL酶聯(lián)親和物，充分混勻；⑤37 ℃溫育60 min后棄盡孔內(nèi)液體，用稀釋好的洗滌液反復(fù)沖洗5次并扣干孔內(nèi)剩余液體；⑥每孔按照次序，分別加入顯色液，并充分混勻，在室溫下避光反應(yīng)15 min；⑦反應(yīng)后每孔加入終止液50 μL，充分混勻，終止反應(yīng)；⑧用酶標儀在450 nm測定OD值。

三、統(tǒng)計方法

結(jié) 果

一、一般情況

實驗4個周期后，空白對照組全部存活，地塞米松組與蒿甲醚組各存活7只，造模組存活6只。與對照組相比，模型組小鼠體重減輕、DAI評分升高，結(jié)腸長度縮短、結(jié)腸重量增加。蒿甲醚/地塞米松干預(yù)組小鼠體重、DAI評分、結(jié)腸長度、重量等參數(shù)均有改善。其中，體重在2組干預(yù)組之間對比，P< 0.05，干預(yù)組分別與模型組、空白對照組對比，P< 0.01；DAI評分在對照組、蒿甲醚/地塞米松干預(yù)組之間無統(tǒng)計學差異，3組分別與造模組對比，P< 0.01。見圖1、圖2。結(jié)腸長度在2組干預(yù)組之間對比，P< 0.05，干預(yù)組分別與模型組、空白對照組對比，P< 0.01；結(jié)腸重量、重量長度比在蒿甲醚/地塞米松干預(yù)組之間無統(tǒng)計學差異，干預(yù)組與對照組、造模組及對照組與造模組之間兩兩對比，P< 0.01。見圖3、圖4。

圖1 各組小鼠體重(蒿甲醚組體重比地米組輕，P < 0.05，蒿甲醚組、地米組分別與對照組及造模組對比，P < 0.01)

圖2 各種小鼠DAI評分(蒿甲醚/地塞米松干預(yù)組之間無統(tǒng)計學差異，2組分別與造模組對比，P < 0.01)

圖3 各組小鼠結(jié)腸長度(蒿甲醚組與地米組之間對比，P < 0.05，蒿甲醚組、地米組分別與造模組、對照組對比，P < 0.01)

圖4 各種小鼠結(jié)腸重量(結(jié)腸重量在蒿甲醚/地塞米松組之間無統(tǒng)計學差異，這兩組與對照組、造模組及對照組與造模組之間兩兩對比，P < 0.01)

二、結(jié)腸病理及組織學表現(xiàn)

對照組結(jié)腸組織無明顯變化，造模組與2組干預(yù)組小鼠結(jié)腸與周圍組織有不同程度的粘連，3組小鼠結(jié)腸有不同程度的縮短，肉眼未見穿孔及瘺管形成，腸管有不同程度的狹窄伴有局部管壁僵硬。沿腸系膜根部縱向剪開腸管后見除正常對照組外其余3組均有不同程度的充血、水腫、糜爛、出血，造模組最嚴重，結(jié)腸黏膜皺襞結(jié)構(gòu)紊亂，腸壁明顯增厚，有部分腸管局部壞死、黏膜剝脫。大體評分2組干預(yù)組之間沒有統(tǒng)計學差異，干預(yù)組分別對比空白對照組及造模組均有統(tǒng)計學差異(P< 0.01)。見圖5。

圖5 各組小鼠大體評分、組織學評分及膠原面積比比較[大體評分、組織學評分、Masson膠原染色下地米組與蒿甲醚組之間均沒有統(tǒng)計學差異，而這兩組分別對比空白對照組及造模組均有統(tǒng)計學差異(P < 0.01)]

光學顯微鏡下，造模組全層可見大量淋巴細胞浸潤，固有層水腫，黏膜肌層、黏膜下層水腫、增厚，可見纖維結(jié)締組織增生。2組干預(yù)組也可見淋巴細胞浸潤，但程度較輕，水腫、增厚也較輕。正常對照組小鼠黏膜幾乎沒有損傷。組織學評分2組干預(yù)組之間沒有統(tǒng)計學差異，干預(yù)組分別對比空白對照組及造模組均有統(tǒng)計學差異(P< 0.01)。見圖5、圖6。

Masson膠原染色下，模型組可見黏膜層、黏膜下層、黏膜肌層和肌層均有膠原纖維表達，以黏膜下層最為顯著。2組干預(yù)組可見上述各層有少量膠原纖維表達，仍以黏膜下層最為顯著，膠原面積比2組之間沒有統(tǒng)計學差異。正常對照組見極少量膠原纖維表達。2組干預(yù)組膠原面積比分別對比空白對照組及造模組均有統(tǒng)計學差異(P< 0.01)。見圖5、圖7。

圖6 各組小鼠結(jié)腸組織光學顯微鏡照片HE染色[A:正常對照組(100倍)；B:地塞米松組(100倍),C:蒿甲醚組(100倍),D:造模組(40倍);組織學評分地塞米松組與蒿甲醚組之間沒有統(tǒng)計學差異，2組分別對比空白對照組及造模組均有統(tǒng)計學差異(P < 0.01)]

三、血清CTGF和PCⅢ表達

模型組小鼠血清CTGF表達高于空白對照組、蒿甲醚干預(yù)組和地塞米松干預(yù)組，模型組與其他三組對比，P均 < 0.01；對照組小鼠血清CTGF表達低于2組干預(yù)組，P均 < 0.01；2組干預(yù)組之間對比，蒿甲醚組表達高于地塞米松組，P< 0.05。模型組小鼠血清PCⅢ表達高于空白對照組、蒿甲醚干預(yù)組和地塞米松干預(yù)組，模型組與其他三組對比，P均 < 0.01；對照組小鼠血清PCⅢ表達低于2組干預(yù)組，P均 < 0.01；2組干預(yù)組之間對比，蒿甲醚組表達高于地塞米松組，P< 0.05。見圖8。

圖7 各組小鼠結(jié)腸組織Masson膠原染色照片[A:正常對照組(40倍),B:地塞米松組(100倍),C:蒿甲醚組(100倍),D:造模組(100倍);膠原面積比地塞米松組與蒿甲醚組之間沒有統(tǒng)計學差異;這兩組膠原面積比分別對比空白對照組及造模組均有統(tǒng)計學差異(P < 0.01)。正常對照組見極少量膠原纖維表達]

圖8 各組小鼠CTGF、PCⅢ表達比較(CTGF及PCⅢ在模型組表達均高于其他三組，P均 < 0.01；在空白對照組表達均低于地米組及蒿甲醚組，P均 < 0.01；在蒿甲醚組表達高于地米組，P < 0.05)

4. 結(jié)腸組織TGF-β1表達

模型組小鼠TGF-β1表達高于空白對照組、蒿甲醚干預(yù)組和地塞米松干預(yù)組，模型組與其他三組對比P均 < 0.01；對照組小鼠TGF-β1表達低于2組干預(yù)組，P均 < 0.01；2組干預(yù)組之間對比，蒿甲醚組表達高于地塞米松組，P值 < 0.05。見圖9。

討 論

腸纖維化被認為是對于慢性炎癥和損傷活動過度的、不可逆的傷口愈合反應(yīng)。腸纖維化、腸狹窄是炎癥性腸病常見的并發(fā)癥[11-12]。現(xiàn)有的治療藥物只能減輕CD腸道炎癥，而對腸纖維化無效[13]。

圖9 各組小鼠TGF-β1表達比較(TGF-β1在模型組表達高于其他三組，P均 < 0.01；在空白對照組表達均低于地米組及蒿甲醚組，P均 < 0.01；在蒿甲醚組表達高于地米組，P < 0.05)

青蒿素及其衍生物是我國科學工作者發(fā)掘祖國醫(yī)藥學寶庫研究開發(fā)的一類新藥，有快速、安全、高效、無耐藥性等優(yōu)點。隨著對其藥理的深入探索和臨床研究的開展，目前已有文獻提示該藥有體外抗纖維化作用，動物實驗證實其有抑制瘢痕增生、抗肺纖維化、抗肝纖維化等作用[5-6,14]。本研究應(yīng)用DSS制備小鼠結(jié)腸炎纖維化模型，并用蒿甲醚進行干預(yù)，用地塞米松作為干預(yù)對照，發(fā)現(xiàn)使用蒿甲醚后能改善DSS所致的小鼠結(jié)腸炎的臨床表現(xiàn)、結(jié)腸組織損傷及膠原面積比，同時可以降低CTGF、PCⅢ、TGF-β1表達，提示蒿甲醚對結(jié)腸炎腸纖維化有抑制作用。

腸纖維化是腸道慢性炎癥的結(jié)果，表現(xiàn)為過度的、異常的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積，異常的ECM收縮形成瘢痕、組織變形，引起腸道梗阻。膠原蛋白是ECM中含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，與纖維連接蛋白(fibronectin)等構(gòu)成ECM主要組成成分。在纖維化腸組織中發(fā)現(xiàn)自CD狹窄腸段分離、培養(yǎng)的成纖維細胞(fibroblasts, FB)等合成Ⅲ型膠原的能力顯著增加。在本研究中，模型組、對照組與干預(yù)組的PCⅢ水平差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)，提示各組小鼠的纖維化程度存在統(tǒng)計學差異。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是多數(shù)組織纖維化的關(guān)鍵細胞因子[15]，其與纖維化發(fā)生發(fā)展、ECM的合成有著密切的聯(lián)系。有研究[16]表明，TGF-β過度表達會促進ECM大量累積，而抑制其降解，是IBD腸纖維化的重要致病原因。TGF-β也能夠促進成纖維細胞自身合成TGF-β，成纖維細胞的這種自分泌作用也是導致纖維化進展的重要原因之一[17]。但TGF-β是一種多效細胞因子，除了在腸纖維化過程中有雙重作用外，還有許多其他作用，如調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等，故這不是一個理想的治療靶點，作為TGF-β下游效應(yīng)分子的CTGF納入了我們的視線。

結(jié)締組織生長因子(CTGF)是1991年BRADHAM等首先在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的[18]，它是一種由349個氨基酸組成，分子量為34 ～ 38KD的富含半胱氨酸的分泌肽，能調(diào)節(jié)纖維化、凋亡、血管發(fā)生、細胞遷移、腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的大分子，與纖維化疾病密切相關(guān)，常介導TGF-β的促纖維化作用[19]。CTGF主要由TGF-β誘導表達，臨床和實驗研究均已證實CTGF的表達與纖維化程度積分呈顯著正相關(guān)，作為TGF-β的特異性下游分子，TGF-β對CTGF基因轉(zhuǎn)錄有明顯的調(diào)控作用，研究表明，在多種組織器官纖維化疾病 (如結(jié)締組織纖維化、病理性瘢痕形成及器官纖維化等)中，TGF-β與CTGF大多協(xié)同表達增加，在缺少CTGF時，TGF-β不能單獨促進組織纖維化進程。CTGF在正常組織中無表達或極低表達[20]，在纖維化狹窄腸段FB中的CTGF蛋白和mRNA明顯過度表達，與正常對照組比較，表達是正常組5倍以上[21]。Vozenin-Brotons等[22]的研究提示在放射性腸纖維化中，CTGF也有高水平表達。這些說明CTGF與纖維化存在正相關(guān)，以FB為主的間質(zhì)細胞CTGF在狹窄腸段的持續(xù)高表達成為腸纖維化形成的基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎造模組的TGF-β1、CTGF的表達均明顯增高，蒿甲醚干預(yù)后，二者的表達水平明顯下降，提示蒿甲醚具有明顯抑制DSS誘導的小鼠結(jié)腸炎腸纖維化的作用，該作用結(jié)果可能是通過下調(diào)TGF-β1、CTGF發(fā)生。