周水岳 杭遠欣 張巖春 戴智勇 潘麗娜 王建武* 方熱軍*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，長沙410128；3.澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司，長沙410005)

母乳作為哺乳動物出生后最重要的食物來源，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和生物活性物質(zhì)，為嬰兒的健康成長和發(fā)育提供了充足的能量和營養(yǎng)[1]。益生元作為母乳中第三大活性營養(yǎng)成分，事實上在奶粉中是缺乏的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道微生物區(qū)系異于普通配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒。母乳中含有豐富的益生元和少量益生菌，如果在普通配方奶粉中添加益生元可以提高其營養(yǎng)價值[3]。益生元是在動物消化道內(nèi)不能被動物自身分泌的消化酶降解，但可以選擇性地刺激腸道有益菌生長的一類物質(zhì)，包括低聚糖、多糖、多元醇、植物提取物、蛋白質(zhì)水解物等[4-5]，其中聚葡萄糖作為一種多糖就具有益生元的作用[2]。目前，廣泛應(yīng)用于人類食品的益生元包括乳果糖、低聚半乳糖、果寡糖、菊粉及其水解物、低聚麥芽糖和抗性淀粉等[6]。有研究表明，臨床試驗中菊糖型果寡糖和低聚半乳糖對人體消化和免疫健康均有良好的效果[7]；低聚半乳糖和聚葡萄糖協(xié)作可以提高豬和SD大鼠養(yǎng)分吸收和可能通過非體液調(diào)控機制提高記憶力[8-9]；聚葡萄糖還有影響?zhàn)B分吸收、免疫調(diào)節(jié)和腸道功能等作用[10]。

2011年，歐洲嬰兒腸胃營養(yǎng)學(xué)會通過科學(xué)數(shù)據(jù)證實，在配方奶粉中添加益生元對健康嬰兒一般不會引起安全和生長方面的副作用[11-12]，但是，目前研究者們對配方奶粉中添加益生元的安全性和功效還沒達成共識[13]。因此，對添加益生元配方奶粉的安全性和功效的研究也成為了從事營養(yǎng)研究的學(xué)者的一項責(zé)任重大的工作。本試驗旨在研究配方奶粉中分別添加低聚糖類益生元和多糖類益生元對SD大鼠生長性能、血液生化指標(biāo)和養(yǎng)分表觀消化率的影響，為配方奶粉進一步模擬母乳和更好地適應(yīng)中國嬰兒健康生長和發(fā)育的營養(yǎng)需要提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

配方奶粉：普通配方奶粉、添加低聚糖類益生元配方奶粉、添加多糖類益生元配方奶粉，均由澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司提供。其中，添加低聚糖類益生元配方奶粉中低聚糖含量為2.13%(低聚果糖含量為1.85%，低聚半乳糖含量為0.28%)，添加多糖類益生元配方奶粉中聚葡萄糖含量為2.20%。

奶液：奶液1是由普通配方奶粉與水按1∶3的比例調(diào)制而成；奶液2是由添加低聚糖類益生元配方奶粉與水按1∶3的比例調(diào)制而成；奶液3是由添加多糖類益生元配方奶粉與水按1∶3的比例調(diào)制而成，現(xiàn)喂現(xiàn)配。

飼糧：飼糧1是由玉米、麥麩和普通配方奶粉按7∶2∶1的比例配制而成；飼糧2是由玉米、麥麩和添加低聚糖類益生元配方奶粉按7∶2∶1的比例配制而成；飼糧3是由玉米、麥麩和添加多糖類益生元配方奶粉按7∶2∶1的比例配制而成。上述飼糧均由湖南某實驗動物有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗動物及分組

試驗動物為48只無特定病原體(SPF)級SD大鼠，15日齡(斷奶前1周)，平均體重(29.39±1.89) g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2014—0011。試驗用SD大鼠飼養(yǎng)于中南大學(xué)SPF級動物實驗室，溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%，12 h光照、12 h黑暗。

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，SD大鼠按體重隨機分為3組，分別為對照組(A組)、低聚糖類試驗組(B組)和多糖類試驗組(C組)，每組16只SD大鼠，單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期為28 d，試驗期間SD大鼠的飼喂情況及方法見表1。

表1 SD大鼠飼喂情況及方法

第2階段中奶液和飼糧按7∶3的比例進行飼喂。

The milk and the feed were mixed in the ratio of 7∶3 in phase 2.

1.3 樣品采集

從試驗期第8天起，每天上、下午共2次，收集每籠SD大鼠的新鮮糞便(約5 g)，清理糞便中毛等雜物，混合均勻，加入 0.5 mL 10%硫酸拌勻，置于-20 ℃冰箱保存。連續(xù)收集糞樣14 d，將糞樣置于65 ℃烘箱中烘干，粉碎，過40目篩，用于測定養(yǎng)分表觀消化率。

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后24 h空腹過夜，在試驗第29天早晨稱重，摘眼球采血后頸椎脫臼處死，打開腹腔，分離胃、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺和小腸，觀察是否有病變，同時稱量胃(生理鹽水清洗內(nèi)容物)、肝臟、脾臟和腎臟的重量。其中，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集的新鮮血樣于室溫靜止30 min后3 000 r/min離心15 min，得血漿，-20 ℃保存，用于測定血漿中游離氨基酸含量；經(jīng)草酸鉀/氟化鈉管采集的血樣-20 ℃保存，用于測定血液葡萄糖含量；用普通血清管采集的血樣靜止30 min，3 000 r/min離心15 min，得血清，-20 ℃保存，用于測定血清指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)檢測及方法

1.4.1 生長性能

記錄SD大鼠每日采食量、初重和末重(第29天早晨)，計算平均日采食量、平均日增重及料重比。

平均日增重(g/d)=(末重-初重)/28；
平均日采食量(g/d)=總采食量/28；
料重比=總耗料量/總增重。

1.4.2 臟器指數(shù)

詳細記錄SD大鼠體重及臟器重量(第29天早晨)，計算臟器指數(shù)，計算公式如下：

臟器指數(shù)=臟器重量(g)/體重(g)。

1.4.3 血液生化指標(biāo)

采用RP-HPLC-FMOC-CL柱前衍生化液相色譜測定血漿中游離氨基酸的含量，具體操作步驟如下。

色譜條件：色譜柱為Silversil C18柱，柱內(nèi)徑5 μm，柱長4.6 mm×150 mm(Dikma)；流動相A，乙腈∶水=10∶90(體積比，含0.05%甲酸)；流動相B，乙腈∶水=90∶10(體積比)；流速為1.0 mL/min。梯度程序：0～8 min，流動相B 24%～35%；8～15 min，流動相B 35%～40%；15～22 min，流動相B 40%～48%；22～25 min，流動相B 48%～64%；25～28 min，流動相B 64%～82%；28～30 min，流動相B 82%～82%；30～35 min，流動相B 82%～24%；38 min，停止。檢測波長：激發(fā)波長(λex)260 nm，發(fā)射波長(λem)305 nm；進樣量：20 μL；柱溫：37 ℃。

衍生反應(yīng)：準(zhǔn)確吸取10 μL(10 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品，加入100 μL硼酸緩沖液(pH=9.0)、20 μL 9-芴基氯甲酸甲酯(5 mmol/L，丙酮)，60 ℃水浴反應(yīng)1 h，加20 μL 1 mol/L鹽酸，離心，進樣20 μL。

樣品處理及測定：準(zhǔn)確量取樣品100 μL，加100 μL甲醇，混勻，室溫放置10 min，15 000 r/min離心10 min，取上清液10 μL和標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣衍生，以峰面積定量。

血清胰島素(Ins)和類胰島素生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，在MB-530多功能酶標(biāo)分析儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)上測定，具體操作步驟如下：按操作說明配制標(biāo)準(zhǔn)品、洗液工作液、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，將各種試劑移至室溫(18～25 ℃)平衡至少30 min，備用；分別設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣本孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100 μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，置37 ℃溫育2 h；棄去液體，甩干，不用洗滌；每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，置37 ℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，每孔200 μL，甩干；每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，置37 ℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，每孔200 μL，甩干；依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色15～30 min；依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用MB-530多功能酶標(biāo)分析儀在450 nm波長下依序測量各孔的光密度(OD)值。

血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(T-BIL)、直接膽紅素(D-BIL)、尿素氮(UN)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)活性及血液葡萄糖含量采用CS-T300全自動生化分析儀(長春迪瑞實業(yè)有限公司)測定，檢測試劑盒由長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司提供；血清堿性磷酸酶(AKP)活性采用微量酶標(biāo)法測定，檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，測定方法參照試劑盒說明書。

1.4.4 養(yǎng)分表觀消化率

飼糧和糞便中的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量參照《飼料分析與檢測》[14]中常規(guī)分析與檢測方法測定，使用酸不溶灰分(AIA)作為指示劑，AIA含量參照GB/T 23743—2009的方法測定，計算養(yǎng)分表觀消化率[15-16]，計算公式如下：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-(M2n/M1n)×

(M1m/M2m)×100。

式中：M1m為飼糧中AIA含量；M2m為糞便中AIA含量；M1n為飼糧中該養(yǎng)分含量；M2n為糞便中該養(yǎng)分含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

釆用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示，P≤0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠生長性能的影響

由表2可知，配方奶粉中無論是添加低聚糖益生元還是多糖益生元對SD大鼠的平均日采食量、平均日增重和料重比均無顯著影響(P>0.05)，但與對照組相比，B組平均日增重提高了3.55%，料重比降低了9.80%，C組平均日增重提高了8.33%，料重比降低了13.06%。

表2 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠生長性能的影響

同行各組數(shù)據(jù)無字母或上標(biāo)字母相同表示無顯著差異(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),with different small letter superscripts mean significant difference (P≤0.05).The same as below.

2.2 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠臟器指數(shù)的影響

由表3可知，3組SD大鼠的胃、肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠血液生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，B組SD大鼠血清HDL-C含量顯著提高(P≤0.05)；C組SD大鼠血清Ins、IGF-Ⅰ和HDL-C含量顯著提高(P≤0.05)，血清UN含量顯著降低(P≤0.05)。

由表5可知，與對照組相比，B組SD大鼠血漿非必需氨基酸中精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala)含量均顯著提高(P≤0.05)，C組SD大鼠血漿非必需氨基酸中Arg、Ser、甘氨酸(Gly)、Ala和酪氨酸(Tyr)含量均顯著提高(P≤0.05)；B組和C組血漿中賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、蘇氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)等必需氨基酸含量均有不同程度的提高，但差異均不顯著(P>0.05)。

表3 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠臟器指數(shù)的影響

2.4 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表6可知，與對照組相比，B組粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率分別提高了2.42%和5.57%，無差異顯著(P>0.05)；C組粗蛋白質(zhì)和粗脂肪表觀消化率分別提高了7.39%和8.20%，差異顯著(P≤0.05)。

3 討 論

3.1 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠生長性能和臟器指數(shù)的影響

配方奶粉中添加益生元對幼齡動物生長性能影響的試驗結(jié)果不盡相同。Costalos等[17]研究表明富含果寡糖和低聚半乳糖的配方奶粉對嬰兒6～12周的生長速度無顯著影響；Ashley等[18]用419個嬰兒進行了為期120 d的試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在配方奶粉中添加益生元對嬰兒14～120日齡的生長速度沒有顯著影響；黃小流等[19]研究表明，飼糧中添加低聚果糖對斷奶SD大鼠的料重比沒有顯著影響；杭蘇琴等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加甘露寡糖對仔豬斷奶第1周的生長性能無顯著影響，而對其斷奶第2周以后的生長性能有顯著影響。相反，有研究發(fā)現(xiàn)，配方奶粉中添加益生元可以增加嬰兒體重，但不會影響其身高和大腦發(fā)育[21-22]。不同研究結(jié)果存在差異的原因可能與益生元種類與用量、飼糧組成及動物種類、生理狀態(tài)和試驗飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)。本試驗中，在配方奶粉中添加益生元可以從一定程度上提高SD大鼠的平均日增重和平均日采食量，降低料重比，但這種影響不顯著，可能與試驗重復(fù)之間數(shù)據(jù)變異較大、試驗周期中換料頻率及SD大鼠生理狀況的改變等有關(guān)，這與一些研究結(jié)果相一致。

表4 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠血清生化指標(biāo)和血液葡萄糖含量的影響

表5 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠血漿中游離氨基酸含量的影響

續(xù)表5項目 Items組別 GroupsABC天冬酰胺 Asn187.50±89.17133.19±84.53183.85±130.82精氨酸 Arg73.50±12.44a238.15±71.31b213.80±49.92b?；撬?Tau1 007.29±502.081 596.84±846.751 919.31±671.88谷氨酰胺 Gln392.24±108.34397.81±80.28436.47±176.92鳥氨酸 Orn1 567.19±281.691 788.38±416.461 819.24±677.58絲氨酸 Ser159.00±32.89a233.51±44.26b289.29±73.42b天冬氨酸 Asp18.43±15.9523.34±9.3830.15±23.82谷氨酸 Glu128.17±40.32146.32±19.11185.26±26.65甘氨酸 Gly214.05±29.89a240.73±35.19a319.22±47.55b丙氨酸 Ala434.21±65.71a817.06±36.73b892.99±122.26b酪氨酸 Tyr171.41±42.99a249.14±26.25a283.59±53.94b脯氨酸 Pro448.39±67.53533.79±112.30538.37±161.44半胱氨酸 Cys392.42±107.05368.28±142.99313.11±69.36

表6 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠養(yǎng)分表觀消化率的影響

健康的動物其臟器指數(shù)均在正常范圍之內(nèi)，內(nèi)臟過大或過小均是其可能發(fā)生病變的征兆[23]。本試驗中3組SD大鼠胃、肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)均無顯著差異，且均在正常生理狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)范圍[24-25]之內(nèi)，說明各配方奶粉沒有改變SD大鼠的臟器結(jié)構(gòu)和功能。

3.2 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠血液生化指標(biāo)的影響

益生元有降低血脂、調(diào)節(jié)脂肪代謝等作用，但具體機制目前尚不清楚[6]。血清中Ins和IGF-Ⅰ含量反映了動物機體三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝情況，但二者的代謝機制和途徑不同，且作用也不盡相同，Ins可能主要在蛋白質(zhì)分解代謝中起抑制作用，而IGF-Ⅰ可能主要在蛋白質(zhì)合成代謝中起促進作用[26]。研究表明，高蛋白質(zhì)水平的配方奶粉可以通過提高血漿和組織中促進Ins生成的相關(guān)氨基酸[如Leu、異亮氨酸(Ile)、Arg、Ala和Phe等[27]]的含量，進而刺激Ins和IGF-Ⅰ的分泌，促進動物機體脂肪沉積和體重增長，但也可能引起肥胖癥[28]。Yang等[29]認為其他氨基酸調(diào)控Ins分泌主要通過以下途徑：1)急性反應(yīng)，如提高谷氨酸脫氫酶活性；2)慢性反應(yīng)，如基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控β細胞新陳代謝。Hogg等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在胎鼠胰島中，氨基酸刺激IGF-Ⅰ的作用比葡萄糖更強烈；在動物早期生長中，氨基酸還可以通過調(diào)控合成代謝途徑和脂肪沉積顯著影響Ins分泌[31-32]。本試驗中，與對照組相比，在配方奶粉中添加低聚糖類益生元顯著提高SD大鼠血清中HDL-C的含量，并顯著提高了血清中Arg、Ser和Ala的含量；在配方奶粉中添加多糖類益生元顯著提高SD大鼠血清中Ins、IGF-Ⅰ和HDL-C的含量，顯著提高血清中Arg、Ser、Gly、Ala和Tyr的含量。同時，本試驗中，在配方奶粉中添加多糖類益生元顯著降低了SD大鼠血清中UN的含量。這與前人研究的結(jié)果相一致，益生元調(diào)控血清中營養(yǎng)物質(zhì)代謝的可能原因有：1)低聚糖和部分聚葡萄糖可以促進動物腸道內(nèi)雙歧桿菌增殖，而雙歧桿菌通過影響膽固醇合成酶系中β-羥基-β-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的活性來介導(dǎo)脂肪代謝[33]；2)機體對蛋白質(zhì)利用率增加，同時血漿中一些與Ins和IGF-Ⅰ生成相關(guān)的氨基酸的含量升高，刺激Ins和IGF-Ⅰ分泌，進而加快機體脂肪沉積。

益生元同時可以降低癌癥和心血管疾病等的發(fā)病率，有研究表明，高密度脂蛋白可以通過調(diào)控ATP結(jié)合蛋白A1和ATP結(jié)合蛋白G1參與反向轉(zhuǎn)運膽固醇，降低巨噬細胞膽固醇含量，同時高密度脂蛋白還具有抗炎、抗氧化等維持機體健康的重要功能[34]，高密度脂蛋白代謝和血清TG含量相關(guān)，血清TG含量越高，高密度脂蛋白越容易降解[35]，本試驗結(jié)果與此基本一致。益生元可能通過調(diào)控血清中CK活性來調(diào)控血壓，研究發(fā)現(xiàn)，CK降低血壓的可能途徑如下：1)降低改變收縮蛋白局部ATP水平及肌球蛋白ATP酶活性；2)促進一氧化氮的生成；3)降低腎性水鈉潴留能力[36-37]。

3.3 配方奶粉中添加益生元對SD大鼠養(yǎng)分表觀消化率的影響

養(yǎng)分表觀消化率的測定可以比較直觀地反映飼糧的可消化性及動物的消化能力[38]。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，在配方奶粉中添加多糖類益生元可以顯著提高SD大鼠粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率；在配方奶粉中添加低聚糖類益生元可以提高SD大鼠粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的表觀消化率，但差異未達到顯著水平。Kawasaki等[39]研究表明，在飼糧中添加低聚果糖對豚鼠氮的養(yǎng)分表觀消化率無顯著影響，但對氮的沉積有顯著提高；陸翔等[40]研究表明，在配方奶粉中添加低聚果糖和低聚半乳糖可以提高SD大鼠蛋白質(zhì)利用率；Martinelli等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在布丁中添加一定量的乳清蛋白和聚葡萄糖可以降低健康成年人的食欲和饑餓感；Ibarra等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在早餐飲食中加入聚葡萄糖可以降低Ins的分泌，而在中餐飲食中添加聚葡萄糖可以降低饑餓感，可能原因是聚葡萄糖提高了機體對養(yǎng)分的消化利用率；同時，權(quán)美平等[43]報道膳食纖維可以促進腸道消化吸收。上述試驗結(jié)果與本試驗結(jié)果基本一致。益生元可能通過促進腸道益生菌增殖來提高機體對養(yǎng)分的消化率，因益生菌可以分泌一種動物機體自身不能分泌的半乳糖苷酶，半乳糖苷酶可以提高粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和多糖等養(yǎng)分的消化吸收效率[44]。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，在配方奶粉中添加低聚糖益生元或多糖益生元均可以改善SD大鼠的血液生化指標(biāo)，提高其養(yǎng)分表觀消化率，從而在一定程度上促進SD大鼠的生長，且以添加多糖類益生元的效果更佳。