董金金 高艷霞 李 妍 李秋鳳 曹玉鳳 劉 博 許利民 李建國*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定071001；3.河北省衡水市農(nóng)牧局，衡水053000；4.河北省隆化縣農(nóng)牧局，隆化068150)

胃腸道是動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場所，犢牛出生后胃腸道消化機(jī)能發(fā)育不健全，直接影響犢牛對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和犢牛的生長發(fā)育。酵母多糖(yeast polysaccharide，YPS)是從酵母細(xì)胞壁中提取出來的一種水溶性多糖，包括β-葡聚糖和甘露寡糖(MOS)[1]，可促進(jìn)動(dòng)物胃腸道早期發(fā)育，提高消化能力，改善動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。因此，研究酵母多糖對(duì)哺乳犢牛胃腸道發(fā)育的作用和機(jī)制，對(duì)促進(jìn)犢牛生長發(fā)育具有重要意義。據(jù)報(bào)道，酵母多糖作為一種綠色添加劑可以提高動(dòng)物的生長性能[2-5]。本實(shí)驗(yàn)室同期研究中發(fā)現(xiàn)，添加1、2、3 g/(頭·d)酵母多糖的犢牛平均日增重(ADG)和干物質(zhì)采食量(DMI)均高于對(duì)照組，其中添加2 g/(頭·d)酵母多糖的犢牛ADG和DMI最高，這可能是由于酵母多糖中甘露寡糖與β-葡聚糖共同作用，增加犢牛采食頻率，提高動(dòng)物腸道消化吸收能力，進(jìn)而提高了采食量和日增重[6]。犢牛飼糧中添加75 mg/kg酵母β-葡聚糖可顯著提高干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)和磷(P)的消化率[7]。在肉牛飼糧中添加酵母細(xì)胞壁可提高酸性洗滌纖維(ADF)和總磷(TP)的表觀消化率[4]。本實(shí)驗(yàn)室同期研究中也發(fā)現(xiàn)添加1、2、3 g/(頭·d)酵母多糖顯著提高了犢牛對(duì)DM、CP、EE、中性洗滌纖維(NDF)和ADF的表觀消化率，說明哺乳犢牛飼糧中添加酵母多糖可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝[6]。關(guān)于酵母多糖可促進(jìn)雞[8]、豬[9]、魚[10]腸道發(fā)育，增加腸道消化酶分泌[11]的研究報(bào)道較多，但有關(guān)酵母多糖對(duì)哺乳犢牛胃腸道發(fā)育及酶活性的研究甚少。因此，本試驗(yàn)旨在探究飼糧中添加不同劑量的酵母多糖對(duì)哺乳犢牛胃腸道發(fā)育及消化酶活性的影響，為酵母多糖在哺乳犢牛飼養(yǎng)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

酵母多糖(福邦牌)由湖北安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)，純度>50%，主要成分及含量如下：20.0%≤β-葡聚糖≤30.0%，20.0%≤α-甘露聚糖肽≤30.0%，肽類及蛋白質(zhì)≥30.0%，幾丁質(zhì)≥2.0%。

試驗(yàn)選擇初生重[(45.00±5.29) kg]相近、健康的中國荷斯坦?fàn)倥?6頭，隨機(jī)分為4組，每組14頭，各組間犢牛平均初生重差異不顯著(P>0.05)。酵母多糖在各組的添加量分別為0(Ⅰ組)、1(Ⅱ組)、2(Ⅲ組)、3 g/(頭·d)(Ⅳ組)。試驗(yàn)期60 d。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)犢牛出生后1 h內(nèi)灌服4 L初乳，之后安置于犢牛島，均單籠飼養(yǎng)，自由飲水。試驗(yàn)期間每日每頭飼喂牛奶4 kg,1～6日齡，酵母多糖添加在牛奶中，7～60日齡添加在犢牛開食料中。7日齡開始補(bǔ)充犢牛開食料，45日齡開始自由采食苜蓿干草。開食料組成及營養(yǎng)水平、鮮奶和苜蓿的營養(yǎng)水平參見文獻(xiàn)[6]。

1.3 樣品采集與處理

1.3.1 瘤胃及小腸食糜樣品采集

各組選取4頭接近平均體重、健康狀況良好的犢牛，在60日齡頸靜脈放血處死，立即剖開腹腔，取出瘤胃和小腸，迅速浸泡于生理鹽水中。結(jié)扎十二指腸與皺胃連接處，剪斷。

首先采集瘤胃食糜樣品于10 mL離心管中，迅速置于液氮中，以備測定瘤胃中食糜的酶活性。除去腸系膜與小腸外部脂肪，將小腸自然平放在瓷盤中，瓷盤下用冰塊降溫，分別取十二指腸、空腸中部食糜10 g放入EP管中，迅速放入液氮中速凍，以備測定小腸食糜的酶活性。

1.3.2 胃腸道組織樣品的采集

取瘤胃前背盲囊及十二指腸10 cm，空腸中段10 cm，用生理鹽水沖洗殘余內(nèi)容物后結(jié)扎，迅速將樣品浸泡在Bouin氏固定液中，用于制作組織切片。

1.4 樣品的測定

1.4.1 食糜中酶活性的測定

瘤胃及腸道食糜中淀粉酶、脂肪酶、羧甲基纖維素酶以及瘤胃食糜的胃蛋白酶和腸道食糜的胰蛋白酶采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按照試劑盒(中生北控生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：201710)說明操作，利用酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，儀器型號(hào)：DNM-9602)進(jìn)行測定。

1.4.2 組織切片的制作與測定

瘤胃及腸道組織切片的制作采用石蠟切片法[12]。

觀察及測定：在顯微鏡(ToupCam)10×4倍光鏡下觀察并照相，用Image J軟件測量瘤胃乳頭長度、寬度以及黏膜厚度，小腸絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度。每個(gè)樣本觀察3個(gè)非連續(xù)切片，每張切片選取3個(gè)視野，每個(gè)視野分別測定2～6組數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并作Duncan氏法多重比較。試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛胃腸道食糜酶活性的影響

2.1.1 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛瘤胃食糜酶活性的影響

由表1可見，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組瘤胃食糜淀粉酶活性比Ⅰ組分別提高了4.36%(P>0.05)、10.48%(P<0.05)、1.88%(P>0.05)。Ⅲ、Ⅳ組瘤胃食糜胃蛋白酶活性顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，分別比Ⅰ組提高了20.04%、38.00%。Ⅲ、Ⅳ組瘤胃食糜脂肪酶活性分別比Ⅰ組提高了20.12%、34.75%(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ組瘤胃食糜羧甲基纖維素酶活性顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，分別比Ⅰ組提高了9.61%、8.45%。

表1 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛瘤胃食糜酶活性的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.1.2 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛十二指腸食糜酶活性的影響

由表2可知，Ⅲ、Ⅳ組十二指腸食糜淀粉酶活性比Ⅰ組分別提高了37.98%、23.95%(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ組十二指腸食糜胰蛋白酶活性比Ⅰ組分別提高了26.17%、42.77%(P<0.01)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組十二指腸食糜脂肪酶活性顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，分別比Ⅰ組提高了19.92%、42.52%、69.33%。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組十二指腸食糜羧甲基纖維素酶活性分別比Ⅰ組提高了9.47%(P<0.05)、26.43%(P<0.01)、7.71%(P<0.05)。

表2 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛十二指腸食糜酶活性的影響

2.1.3 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛空腸中段食糜酶活性的影響

由表3可見，Ⅲ組空腸中段食糜淀粉酶活性比Ⅰ組提高了18.70%(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組空腸中段食糜胰蛋白酶活性比Ⅰ組分別提高了2.17%(P>0.05)、7.14%(P<0.01)、1.79%(P>0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組空腸中段食糜脂肪酶活性比Ⅰ組提高了30.34%、65.55%、47.57%(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組空腸中段食糜羧甲基纖維素酶活性高于Ⅰ組，Ⅲ組比Ⅰ組提高了16.88%(P<0.05)。

表3 酵母多糖對(duì)哺乳犢?？漳c中段食糜酶活性的影響

2.2 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛胃腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表4和圖1可見，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組瘤胃乳頭長度比Ⅰ組分別提高了11.58%、27.55%、15.86%(P<0.01)，瘤胃乳頭寬度比Ⅰ組分別提高了17.72%、37.23%、25.60%(P<0.05)，瘤胃黏膜厚度比Ⅰ組分別提高了8.08%(P<0.05)、30.93%(P<0.01)、26.38%(P<0.01)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組十二指腸絨毛高度比Ⅰ組分別提高了9.74%、23.91%、14.61%(P<0.01)，隱窩深度比Ⅰ組分別降低了7.06%(P>0.05)、19.42%(P<0.05)、26.56%(P<0.05)，絨毛高度/隱窩深度(V/C)顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅳ組最高，Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著(P<0.05)。Ⅲ組空腸中段絨毛高度比Ⅰ組提高了24.56%(P<0.05)，隱窩深度比Ⅰ組降低了19.49%(P<0.05)，V/C也顯著高于Ⅰ組(P<0.05)。

表4 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛瘤胃和小腸形態(tài)發(fā)育的影響

3 討 論

3.1 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛胃腸道食糜酶活性的影響

動(dòng)物消化酶活性的變化直接反映了動(dòng)物采食性能的變化，消化酶活性的高低直接影響了動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用的程度。孫洪新[7]試驗(yàn)報(bào)道，羔羊空腸中淀粉酶活性最大。王寶山[13]研究也表明，小尾寒羊各段小腸中淀粉酶活性不同，淀粉酶活性在空腸段最高，顯著高于十二指腸淀粉酶活性。Wu等[14]給魚飼喂魔芋甘露寡糖和甘露寡糖，提高了小腸中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性。邢廣林[15]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞飼糧中添加甘露寡糖提高了十二指腸消化酶活性，當(dāng)添加0.1%的甘露寡糖時(shí)，十二指腸淀粉酶活性顯著高于不添加組。楊敏等[16]的研究結(jié)果表明，飼料中添加0.20%～0.50%的甘露寡糖能提高鰻鱺腸道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，說明飼料中適宜濃度的甘露寡糖可以促進(jìn)歐洲鰻鱺腸道消化酶的分泌，從而促進(jìn)鰻鱺生長。譚崇桂等[17]在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加0.2% β-葡聚糖及0.4%甘露寡糖可顯著提高胃蛋白酶和肝胰腺脂肪酶活性。覃志彪[18]在研究β-葡聚糖對(duì)奧尼羅非魚消化酶活性的影響中發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纖維素酶活性有較大的影響，在保證奧尼羅非魚正常生長發(fā)育的同時(shí)，能夠有效地增強(qiáng)消化酶活性，增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。而高進(jìn)[19]在大黃魚稚魚飼料中添加酵母細(xì)胞壁多糖的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁多糖對(duì)腸道胰蛋白酶和淀粉酶活性無顯著影響。羧甲基纖維素酶能膨脹纖維素和羧甲基纖維素，并以隨機(jī)方式內(nèi)切纖維素聚合體并產(chǎn)生纖維素糊精、纖維素二糖及葡萄糖，羧甲基纖維素酶在纖維素消化過程中起著非常重要的作用[20]。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加2 g/(頭·d)的酵母多糖可以提高瘤胃酶活性和腸道酶活性，酵母多糖促進(jìn)了纖維分解菌的增殖與纖維素酶的產(chǎn)生，提高消化酶對(duì)淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)的酶解作用，促進(jìn)胃腸道的形態(tài)發(fā)育，從而改善瘤胃整體發(fā)酵功能。

A：瘤胃前背盲囊；B：十二指腸中段；C：空腸中段。

A: rumen prodorsum blind sac; B: middle section of duodenum; C: middle section of jejunum.

圖1酵母多糖對(duì)哺乳犢牛瘤胃和小腸形態(tài)發(fā)育的影響

Fig.1 Effects of yeast polysaccharide on rumen and intestinal morphological development of sucking calves (40×)

3.2 酵母多糖對(duì)哺乳犢牛胃腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

瘤胃功能的建立是瘤胃內(nèi)容物經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸刺激的結(jié)果。Lesmeister等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳頭高度、乳頭寬度和黏膜厚度是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)育的重要指標(biāo)。周懌等[22]在酵母β-葡聚糖對(duì)犢牛胃腸道的影響研究中得出，瘤胃乳頭長度、乳頭寬度和黏膜厚度隨飼糧中酵母β-葡聚糖含量的增加而增加。本試驗(yàn)也得到相似結(jié)果，犢牛飼糧中添加2 g/(頭·d)的酵母多糖可顯著提高瘤胃乳頭長度、乳頭寬度和黏膜厚度，其原因可能是酵母多糖增加了瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量，促進(jìn)了瘤胃功能的早期建立，從而加快了瘤胃的發(fā)育。

犢牛的小腸在反芻前階段對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收方面有重要的作用。小腸的絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度及V/C是衡量其消化吸收功能的重要指標(biāo)[23]。絨毛高度和細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)關(guān)系，且絨毛高度越高，成熟的上皮細(xì)胞越多[24]；隱窩深度反映了細(xì)胞的成熟率，隱窩深度變深，表明小腸吸收養(yǎng)分功能降低，反之，隱窩變淺，小腸消化吸收功能增強(qiáng)[25]；V/C則是綜合反映小腸功能狀態(tài)的指標(biāo)，其比值升高表示小腸黏膜的改善和其消化吸收功能的增強(qiáng)[26]。李玉欣等[27]在仔豬飼糧中添加畢赤酵母甘露寡糖，發(fā)現(xiàn)空腸絨毛高度顯著增加，隱窩深度顯著降低，V/C顯著升高。黃俊文等[28]試驗(yàn)研究表明，甘露寡糖對(duì)仔豬小腸絨毛高度及V/C的增加具有顯著作用。De Los Santos等[29]在火雞飼糧中添加酵母提取的甘露寡糖，十二指腸、空腸的絨毛高度和隱窩深度始終高于不添加組，結(jié)果表明補(bǔ)充甘露寡糖可以加速胃腸發(fā)育成熟。溫若竹[30]的研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加甘露寡糖顯著提高了十二指腸的V/C，且空腸V/C也基本呈升高趨勢。Ferket等[31]研究表明，添加甘露寡糖并不能提高肉仔雞小腸絨毛高度，但卻顯著降低了隱窩深度，且與對(duì)照組相比，V/C也顯著增加。Muthusamy等[32]添加酵母細(xì)胞壁顯著提高了肉雞空腸絨毛高度。此外，給半滑舌鰨稚魚飼料添加甘露寡糖，其微絨毛高度和皺襞高度顯著高于不添加組[33]。在本試驗(yàn)中，添加2 g/(頭·d)的酵母多糖的犢牛十二指腸、空腸的絨毛高度與V/C高于其他組，表明由于絨毛表面積增加從而促進(jìn)了上皮細(xì)胞的成熟，提高了犢牛對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收，增加了絨毛尖端消化酶的分泌活動(dòng)，從而提高消化率[34]，而隱窩深度降低則可以說明酵母多糖提高了小腸的消化吸收能力。

4 結(jié) 論

添加酵母多糖能促進(jìn)犢牛胃腸道形態(tài)發(fā)育，提高胃腸道消化酶活性。在本試驗(yàn)條件下，哺乳犢牛飼糧中酵母多糖的適宜添加量為2 g/(頭·d)。