權(quán)素玉 南雪梅 蔣林樹 熊本海*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.北京農(nóng)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

隨著生物進(jìn)化過程，原核生物和真核生物均已進(jìn)化出簡潔而高效的細(xì)胞間通訊策略。經(jīng)典的細(xì)胞生物學(xué)認(rèn)為，細(xì)胞間通訊有以下2種方式：通過直接接觸相互作用或者分泌可溶性因子如激素、生長因子、細(xì)胞因子等間接作用。近十多年的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡，尤其是外泌體，作為第3種新發(fā)現(xiàn)的重要的細(xì)胞間通訊載體，能夠介導(dǎo)細(xì)胞之間蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，廣泛影響機(jī)體的生理病理過程[1]。目前，畜牧學(xué)關(guān)于外泌體為數(shù)不多的研究集中于乳中，林德麟等[2]綜述了豬乳、人乳和牛乳中外泌體miRNAs的異同。miRNAs是外泌體重要的生物活性成分，被外泌體包裹以后可抵抗幼畜胃腸道的消化及血液中RNase的分解，通過血液循環(huán)運(yùn)送至免疫器官調(diào)控其基因表達(dá)，為幼畜提供重要的免疫保護(hù)機(jī)制[1]。

1 外泌體的來源及發(fā)現(xiàn)

1983年，Pan等[3]首次發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的未成熟綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞在分化過程中可釋放由內(nèi)吞作用產(chǎn)生的多囊泡聚集體，該小囊泡里含有細(xì)胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，隨后，這些多囊泡聚集體被命名為外泌體。最初，研究者認(rèn)為外泌體是清除細(xì)胞膜碎片和淘汰細(xì)胞膜表面分子的細(xì)胞組分，將被溶酶體徹底降解，不再回到細(xì)胞外環(huán)境循環(huán)利用。也有人認(rèn)為外泌體是培養(yǎng)基中死細(xì)胞膜碎片被分離純化后的產(chǎn)物。10年后，Raposo等[4]闡明這些囊泡也可從Epstein Barr病毒侵染的B淋巴細(xì)胞分離出來，并具有遞呈抗原和誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的功能。2007年，外泌體內(nèi)含物RNAs和miRNAs被發(fā)現(xiàn)，其作為新的細(xì)胞間通訊介質(zhì)引起了研究者們極大的興趣[1]。伴隨著這些開創(chuàng)性研究的推進(jìn)，研究者發(fā)現(xiàn)包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞可分泌外泌體，且外泌體天然存在于各種體液，如血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁等，至此，人們逐漸認(rèn)識到其在保障動物機(jī)體健康成長過程中發(fā)揮了重要作用，外泌體在癌癥、自身免疫疾病、生理調(diào)控等方面的研究如雨后春筍般涌現(xiàn)出來。

2 外泌體生物生成

細(xì)胞外囊泡指的是以進(jìn)化保守的方式分泌出細(xì)胞的含有細(xì)胞膜的囊泡，根據(jù)其大小、生成方式及組分主要分為3類：1)外泌體，細(xì)胞膜逆出芽后在核內(nèi)體產(chǎn)生，形成多囊泡聚合體后由細(xì)胞膜釋放，直徑30～150 nm。2)細(xì)胞微泡，又稱細(xì)胞膜微?；蛘吆送忸w粒體，以外向出芽的方式由細(xì)胞膜裂變產(chǎn)生，直徑100～350 nm。3)凋亡小體，在細(xì)胞凋亡過程中由細(xì)胞膜出泡產(chǎn)生，直徑500～1 000 nm[5]。

外泌體的生成起始于含有表面蛋白的細(xì)胞膜內(nèi)向出芽(即內(nèi)吞作用)形成的早期外泌體。早期外泌體在囊泡分揀蛋白如轉(zhuǎn)運(yùn)必需核內(nèi)體復(fù)合物(endosomal complex required for transport，ESCRT)的作用下識別、分類、挑選外泌體內(nèi)含蛋白生成多囊泡體，或者在神經(jīng)酰胺的協(xié)助下生成多囊泡體，該過程根據(jù)是否需要ESCRT的參與分為ESCRT依賴途徑及ESCRT非依賴途徑。目前，miRNAs進(jìn)入外泌體的分選機(jī)制尚不明確。生成的多囊泡體一部分被溶酶體降解，一部分與細(xì)胞膜融合，釋放外泌體。圖1為外泌體的生物生成及釋放示意圖[6-7]。

3 外泌體主要組分及功能

3.1 蛋白質(zhì)及相關(guān)功能

分析外泌體的生物組成時(shí)，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含蛋白的變化范圍非常有限，它不含核蛋白、線粒體蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白及高爾基體蛋白。所有已發(fā)現(xiàn)的外泌體蛋白均來源于細(xì)胞溶質(zhì)、內(nèi)吞小泡或細(xì)胞膜。與其來源細(xì)胞相比，外泌體不僅僅是細(xì)胞膜碎片，因?yàn)槠鋬?nèi)蛋白不含一些在膜表面表達(dá)豐富的蛋白，如樹突狀細(xì)胞Fc受體[8]、T細(xì)胞CD28[9]、CD40L、CD45、B細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體[10]。無論其分泌細(xì)胞是什么，多數(shù)外泌體的內(nèi)含蛋白種類相似，只有小部分蛋白是細(xì)胞特異性的，這部分特異蛋白可反映出其分泌細(xì)胞的生理病理狀態(tài)[11]。典型的外泌體蛋白包括血小板來源生長因子受體、乳凝集素、跨膜蛋白、溶酶體相關(guān)膜蛋白-2B、膜轉(zhuǎn)運(yùn)及融合蛋白如泛素、鳥苷三磷酸酶(GTPases)、熱休克蛋白(HSPs)、脂相關(guān)蛋白、磷脂酶等[12]。外泌體中一些富含的蛋白通常作為其標(biāo)志物，包括四分子交聯(lián)體家族成員9(CD9、CD63、CD81和CD82)，14-3-3蛋白，肌球蛋白重鏈(MHC)分子細(xì)胞質(zhì)蛋白如HSPs、腫瘤易感基因101(Tsg101)蛋白及ESCRT-3結(jié)合蛋白Alix。CD9、CD63和CD81最初被認(rèn)為是外泌體特有標(biāo)記物，但現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其也存在于凋亡小體和細(xì)胞微泡[13]。

Endocytosis：內(nèi)吞作用；Early endosome：早期外泌體；ESCRT: 轉(zhuǎn)運(yùn)必需核內(nèi)體復(fù)合物 endosomal complex required for transport；Multivesicular body：多囊泡體；Membrane fusion：膜融合；Original cell：來源細(xì)胞；Recipient cell：受體細(xì)胞；Surface protein：膜表面蛋白；Exosome：外泌體。

圖1外泌體的生物生成及釋放

Fig.1 Biogenesis and release of exosome

由于外泌體攜帶大量可變的特殊蛋白，其所攜帶的蛋白可決定其在不同通路中的功能，因此外泌體被視為矢量信號小泡。外泌體膜外暴露的受體或配體負(fù)責(zé)使其定位到特定的細(xì)胞或細(xì)胞外區(qū)域。隨后，外泌體可通過與靶細(xì)胞膜表面受體或配體結(jié)合或內(nèi)化激活胞內(nèi)信號通路或改變其細(xì)胞表型[14]。特殊的外泌體蛋白如MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在一些信號通路下游非?；钴S，如整合蛋白及Ca+信號通路[15]、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路及自然殺傷細(xì)胞群2D(NKG2D)信號通路[16]。諸如HSP60、HSP70這樣的HSPs及主要存在于免疫細(xì)胞膜的表面受體CD14、CD91、Toll樣受體(TLR)-2、TLR-4和氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)，CD94/CD56就是經(jīng)典的配體-受體相結(jié)合的模型[17]。

除了通過膜表面蛋白介導(dǎo)細(xì)胞間通訊作用外，外泌體還攜帶一些重要的可溶性蛋白介質(zhì)，如細(xì)胞因子。外泌體相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)運(yùn)最為熟知的例子是白細(xì)胞介素(IL)-1β，IL-1β不僅可在分泌性溶酶體與細(xì)胞膜融合后釋放，也可由外泌體產(chǎn)生[18]。與IL-1β相似，IL-18也屬于無N-末端信號肽，在受到炎癥復(fù)合物的激活后被外泌體攜帶由巨噬細(xì)胞表面分泌出來[19]。趨化因子是一類非常重要的獨(dú)特的細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL8和CX3CL1可由凋亡的淋巴細(xì)胞外泌體分泌[20]。

3.2 RNA及相關(guān)功能

2007年，首次發(fā)現(xiàn)小鼠和人肥大細(xì)胞外泌體均含有mRNAs和miRNAs，并且可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞發(fā)揮生理功能。外泌體的來源和不同的檢測方法都會引起最終得到的RNA的種類和含量的差異。測序分析表明，在人類血漿外泌體RNA中，miRNAs的含量是最豐富的，約593種，5種最常見的miRNAs(miR-99a-5p、miR-128、miR-124-3p、miR-22-3p和miR-99b-5p)占了總量的48.99%，核糖體RNA占9.16%，長鏈非編碼RNA占3.36%，piwi蛋白互作RNA占1.31%，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA占1.24%，核小RNA占0.18%，核仁小RNA占0.01%[21]。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基來源外泌體含有多種RNA：miRNAs、mRNAs、rRNA、tRNA、piRNA、RefSeq和ncRNA[22]。

外泌體為其內(nèi)含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA(尤其是mRNAs和miRNAs)提供了保護(hù)，使其免受酶類降解，并通過內(nèi)吞作用為其內(nèi)含成分提供了進(jìn)入細(xì)胞的途徑。人間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體約含有239種mRNAs，多數(shù)與細(xì)胞增殖分化和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其中的2個mRNA可在鼠體內(nèi)外腎上皮細(xì)胞翻譯為完整的蛋白質(zhì)，表明外泌體可轉(zhuǎn)移有活性的mRNAs[23]。肥大細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)和正常狀態(tài)下外泌體所攜帶的mRNAs含量差異顯著，表明外泌體所攝取的mRNAs受到細(xì)胞的生理狀態(tài)和應(yīng)激的調(diào)節(jié)，可能在維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[24]。同樣，心肌細(xì)胞外泌體所攜帶的mRNAs受到了生長因子的調(diào)控[25]，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在低氧環(huán)境下外泌體攜帶的mRNAs和蛋白均受到影響[26]，表明外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAs的功能與動物細(xì)胞的生理狀態(tài)密切相關(guān)。

外泌體中的miRNAs可通過血液循環(huán)運(yùn)輸而不被血液中的RNA酶降解，是外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的基礎(chǔ)。miRNAs長度為18～25 nt，最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為帶發(fā)卡結(jié)構(gòu)的pri-miRNAs，Drosha釋放出pri-miRNAs的發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成pre-miRNAs，Dicer負(fù)責(zé)清除pre-miRNAs上3′和5′臂上的環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成miRNAs雙鏈，miRNAs雙鏈與Ago蛋白結(jié)合，丟棄隨從鏈，向?qū)ф溑cmiRNAs誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(miRISC)互補(bǔ)，最終形成成熟的miRNAs以調(diào)控目標(biāo)mRNA的表達(dá)[27]。選擇性降解外泌體中部分miRNAs是一種潛在的快速調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方式，也是一種抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散可能的手段。

外泌體介導(dǎo)的miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞的免疫功能相關(guān)。在免疫細(xì)胞突觸形成過程中，T細(xì)胞來源的外泌體攜帶的miRNAs，如miR-335單向轉(zhuǎn)移進(jìn)入抗原遞呈細(xì)胞調(diào)節(jié)其基因表達(dá)[28]。乳源外泌體能夠抑制Anti-CD3和Anti-PHA誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性群組的數(shù)量[29]。免疫相關(guān)miRNAs(miR181a和miR-17)在人分娩后最初的6個月乳外泌體中高表達(dá)，表明外泌體可介導(dǎo)miRNAs在母體和嬰兒之間的傳遞，對嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育可能有重要影響[30]。

3.3 脂質(zhì)及相關(guān)功能

外泌體脂質(zhì)對于囊泡發(fā)揮其生理功能有重要作用。盡管不同來源的外泌體脂質(zhì)組成成分不同，但與其來源細(xì)胞相比，都含有豐富的鞘磷脂、膽固醇和鞘糖脂。大量的鞘磷脂和膽固醇能夠鞏固外泌體結(jié)構(gòu)，提高其對不良理化環(huán)境的抗性[31]。另外，外泌體膜雙分子層結(jié)構(gòu)也有利于其在不同的細(xì)胞外環(huán)境中保持穩(wěn)定性。外泌體穩(wěn)定性的研究對外泌體載體藥物的開發(fā)有重要意義。

4 外泌體分離鑒定

目前已鑒定出各類細(xì)胞外囊泡的一些特點(diǎn)，但仍缺乏一種被廣泛接受的分類標(biāo)準(zhǔn)。典型的分離方法并不能準(zhǔn)確區(qū)分開或者純化各種囊泡，只能得到多囊泡復(fù)合體，因此，多種技術(shù)聯(lián)合使用，如差速離心、密度梯度離心、過濾、排阻色譜等能夠得到相對單一的囊泡[32]。目前主要存在以下幾種外泌體分離純化技術(shù)：超速離心法、基于大小分離法、免疫親和性捕捉法、外泌體沉淀法[33]。

超速離心法是分離外泌體的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法操作簡單，技術(shù)難度低，耗時(shí)不長，樣品無需預(yù)處理，但由于外泌體的不均一性及大小與其他細(xì)胞外囊泡重合，該方法分離得到的外泌體會含有其他的細(xì)胞外囊泡[34]。Théry等[35]詳細(xì)介紹了提取細(xì)胞培養(yǎng)基上清液及各種生物體液如尿液、血漿、血清、腹水等外泌體的步驟，是目前分離外泌體最經(jīng)典的方法。超濾法是基于大小分離外泌體較為常用和成熟的技術(shù)，其原理是利用限制特定分子重量和大小的超濾膜將其分離。超濾比超速離線節(jié)約時(shí)間，也不需要特殊的儀器設(shè)備，但超濾時(shí)施加的壓力比較大，導(dǎo)致體積大的囊泡變形和破裂，可能影響后續(xù)的分析結(jié)果[36]。外泌體膜表面存在大量的蛋白和受體，可通過這些蛋白與抗體的特異性結(jié)合開發(fā)免疫親和性分離技術(shù)[34]，諸如CD63這樣存在于外泌體表面的特異性蛋白分子為復(fù)雜樣品分離外泌體提供了策略。

外泌體的鑒定需要通過電子顯微鏡來進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。對于組織細(xì)胞來說，標(biāo)準(zhǔn)的電子顯微鏡制片過程包括固定、脫水、包埋、切片，而這一過程不適用于外泌體，因?yàn)樵诿撍鞍襁^程中會損壞外泌體膜，因此，外泌體的制片需要特殊的方法[28]。當(dāng)在電子顯微鏡下觀察時(shí)，外泌體呈典型的杯狀形態(tài)，直徑為30～150 nm，扁平球狀[37]。外泌體進(jìn)一步鑒定需要蛋白質(zhì)組學(xué)分析、Western Blot、熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)等手段的輔助。

5 小 結(jié)

外泌體于1983年首次被發(fā)現(xiàn)，其后十多年里一直被當(dāng)做細(xì)胞廢棄物從而忽略了這方面的研究。近年來，人們逐漸認(rèn)識到了外泌體不僅可介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，而且對機(jī)體生理病理過程有重要影響。鑒于外泌體在維持動物內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡中的重要作用，其在動物疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用不言而喻，目前尚需這方面的研究。