任 瑋，王 湘，包 瑛，高新茹

西安市兒童醫(yī)院1門診內(nèi)科，3腎內(nèi)科；2西安醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，陜西 西安 710003；4西北婦女兒童醫(yī)院超聲中心，陜西 西安 710061

腎足細(xì)胞在腎小球?yàn)V過中起至關(guān)重要的作用，是組成濾過屏障的主要成分[1]。在對(duì)奧爾波特綜合征病人的研究中顯示，足細(xì)胞數(shù)量和密度的減少會(huì)誘發(fā)蛋白尿，腎小球硬化癥，腎功能減低等疾病[2]。雌激素影響腎臟疾病的多種生理病理功能，包括對(duì)血流動(dòng)力學(xué)、系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)、膠原代謝、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的釋放以及腎小球?yàn)V過等多方面調(diào)節(jié)。楊霽云等研究表明，微小病變是腎病病理的常見類型，兒童發(fā)病率達(dá)到76%[3]。電鏡下足細(xì)胞的足突融合是微小病變的臨床特點(diǎn)，也是小兒腎病最常見的病理變化，發(fā)病高峰為3～4歲[3]。病重時(shí)，足細(xì)胞與腎小球基底膜分離、脫落、凋亡。因此，探討腎足細(xì)胞凋亡的機(jī)制有助于小兒腎病綜合征病理研究。但目前關(guān)于足細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究還有不足，對(duì)腎足細(xì)胞的增殖機(jī)制還知之甚少?，F(xiàn)有研究表明，雌激素可通過雌激素相關(guān)受體γ抑制腎小球足細(xì)胞的凋亡[4]。而本文主要研究雌激素對(duì)腎足細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能的影響機(jī)制，希望對(duì)小兒腎病綜合征的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

小鼠腎足細(xì)胞系MPC5（上海酶研生物科技有限公司，貨號(hào)：56687）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen）；pcDNA3.1（+）空載體（美國 Invitrogen）；小 鼠 anti-JAK1、anti-JAK2、anti-p-JAK2（Y1007）、anti-STAT3以及anti-p-STAT3（Y705）抗體（美國Abcam）；RNA提取試劑盒（美國Sigma-Aldrich，貨號(hào)：RNB100-50RXN）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（MMLV）（美國Invitrogen）；PCR試劑盒（日本Takara）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）；MTT試劑盒（中國碧云天）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將MPC5細(xì)胞系置于含有10%牛胎兒血清的DMEM 培養(yǎng)基中，充分吹打后移入96孔板中，保持細(xì)胞密度為1×105/mL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h換液1次，72 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染

構(gòu)建酪氨酸磷酸酯酶O（PTPRO）過表達(dá)載體時(shí)，將來自正常小鼠cDNA的PTPRO片段在BamHI和EcoRI位點(diǎn)之間克隆至購買的pcDNA3.1（+）空白載體中，以E. coli DH5α細(xì)胞進(jìn)行PTPRO的豐度表達(dá)。PTPRO引物如下：上游引物5’-gga ACC ACT GAC CTG TCC CAC TC-3’，下游引物5’-ctc GGT GTT GCT CCC TCT CTC AG-3’。采用限制性酶切和DNA測序鑒定PTPRO重組質(zhì)粒。隨后，通過Lipofectamine 2000介導(dǎo)將pcDNA3.1（+）/PTPRO和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入MPC5細(xì)胞中，western blot 和 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。ERα和ERβ過表達(dá)載體的構(gòu)建同上。

1.4 Western blot

用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行總蛋白的定量。將定量后的總蛋白用10%SDS-PAGE分離，NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，3%（v/v）BSA封閉45 min，孵育一抗anti-JAK1（1：1000）、anti-JAK2（1：5000）、anti-p-JAK2（Y1007）（1：1000）、anti-STAT3（1：1000）以及anti-p-STAT3（Y705）（1：2000）抗體4 ℃過夜或者37 ℃ 4 h，TBST洗3 min/次×3，孵育山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1：10000）1 h，TBST洗3 min/次×3，ECL發(fā)光。β-actin作為內(nèi)參。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)及Quantity One4.62進(jìn)行條帶的記錄及定量。

1.5 RT-PCR

采用RNA提取試劑盒提取總RNA，取3 μL總RNA測濃度以及純度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV）進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，PCR試劑盒進(jìn)行PTPRO 目的基因擴(kuò)增。選用β-actin基因?yàn)閮?nèi)參。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)及Quantity One4.62進(jìn)行條帶的記錄及定量。引物采用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)并由Invitrogen合成。PTPRO（mouse）NCBI序列號(hào)：NM_001164401，上游引物（5'-3'）acc act gac ctg tcc cac tc，下游引物（5'-3'）agg tgt tgc tcc ctc tct ca，產(chǎn)物長度172 bp，退火溫度60.0 ℃。

1.6 細(xì)胞增殖檢測

按照MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒的說明書進(jìn)行細(xì)胞增殖的檢測，將細(xì)胞配制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×104細(xì)胞接種于96孔板上，嚴(yán)格按照MTT試劑盒說明書進(jìn)行操作，讀取各孔的A570nm值，空白孔（只加培養(yǎng)液）調(diào)零，每組重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雌激素對(duì)小鼠腎足細(xì)胞中PTPRO的表達(dá)的影響

PTPRO的表達(dá)隨17β-Estradiol（E2）劑量的增加而減少，而隨E2拮抗劑tamoxifen劑量的增加而增加（P＜0.05，圖1）。

圖1 17β-Estradiol（E2）以及其拮抗劑tamoxifen對(duì)PTPRO的表達(dá)的影響

2.2 雌激素結(jié)合不同受體對(duì)小鼠腎足細(xì)胞中PTPRO表達(dá)的影響

圖2A表示鑒定ERα和ERβ過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效果。當(dāng)E2結(jié)合ERα?xí)r，可抑制小鼠腎足細(xì)胞中PTPRO表達(dá)（P=0.0470）；而當(dāng)E2結(jié)合ERβ時(shí)，可徹底阻止小鼠腎足細(xì)胞中PTPRO表達(dá)（P=0.0232，圖2）。

2.3 PTPRO對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的影響

PTPRO對(duì)JAK1蛋白表達(dá)沒有影響（P＞0.05），可提高JAK2、p-JAK2（Y1007）、STAT3以及p-STAT3（Y705）蛋白的表達(dá)（P＜0.05，圖3）。

2.4 雌激素通過抑制PTPRO表達(dá)的促進(jìn)腎小球足細(xì)胞增殖

E2可抑制腎小球足細(xì)胞的生長抑制率（P＜0.05），促進(jìn)其增殖。而PTPRO過表達(dá)可提高E2誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞的生長抑制率的降低（P＜0.05，圖4）。

圖2 雌激素結(jié)合不同受體對(duì)PTPRO表達(dá)的影響

圖3 PTPRO對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的影響

3 討論

小兒腎病綜合癥由多種病因?qū)е履I小球基底膜通透性增加，從而大量蛋白從尿中丟失[5-6]。足細(xì)胞附著于腎小球基底膜外側(cè)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基膜一起構(gòu)成腎小球血液濾過屏障[7-9]。因此，足細(xì)胞凋亡會(huì)增加腎小球基底膜通透性，誘發(fā)蛋白尿，是小兒腎病綜合征的發(fā)病因素之一[8，10-11]，而足細(xì)胞增殖則可抵御小兒腎病綜合征的發(fā)生。

圖4 雌激素通過抑制PTPRO表達(dá)的阻止腎小球足細(xì)胞增殖

對(duì)大鼠腎包裹性高血壓模型研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠去勢可減輕蛋白尿、腎小球和腎小管的損傷程度，而加用雙氫睪酮?jiǎng)t抑制該保護(hù)作用；雌性大鼠去勢可加重腎小球和腎小管的損傷程度，加用17β-雌二醇則可減輕去勢加重的腎臟損傷，而加用雙氫睪酮?jiǎng)t抑制該保護(hù)作用[12]。故雄激素對(duì)腎包裹性高血壓誘導(dǎo)的腎損傷有加重作用，而雌激素對(duì)其有保護(hù)作用。與本研究相符，雌激素可促進(jìn)腎小球足細(xì)胞增殖，保護(hù)腎損傷。Fung等[13]對(duì)1044例絕經(jīng)后女性進(jìn)行了10年的橫斷面觀察，發(fā)現(xiàn)使用雌激素替代治療組婦女血壓明顯低于不使用雌激素替代治療組婦女，前者腎小球?yàn)V過率明顯高于后者；10年后，前者血壓明顯下降，尿白蛋白/肌酐比值明顯下降，而腎小球?yàn)V過率無明顯變化。說明絕經(jīng)后雌激素替代治療有利于血壓、腎小球?yàn)V過率和尿白蛋白/肌酐等反映慢性腎臟疾病進(jìn)展指標(biāo)。因此，本研究表明，雌激素對(duì)腎小球足細(xì)胞的增殖作用，可進(jìn)一步降低腎小球基底膜通透性，降低蛋白尿，預(yù)防腎病綜合癥及小兒腎病綜合征的發(fā)生。

PTPRO有6種轉(zhuǎn)錄變體，全長 PTPRO 在腎和腦中表達(dá)最高，在其他組織包括肝臟、乳腺等也有較高的表達(dá)[14]；研究發(fā)現(xiàn)，PTPRO在原發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化、嚴(yán)重IgA腎病以及實(shí)驗(yàn)性足細(xì)胞損傷導(dǎo)致足突過程消失等多種蛋白尿性腎病中不表達(dá)[15-17]。在分離的大鼠和兔腎小球中，采用特異性抗體封閉PTPRO可提高白蛋白的滲透性，進(jìn)一步說明PTPRO在維持腎小球選擇通透性中起至關(guān)重要的作用[18]。在女性子癇前期的腎損傷中，足細(xì)胞脫落，PTPRO的表達(dá)降低[19]。研究表明，雌激素-雌激素受體復(fù)合物（E2-ER）可以調(diào)節(jié)PTPRO的轉(zhuǎn)錄，并且ERα與ERβ在調(diào)節(jié)過程中扮演著相反的角色。與本研究結(jié)果一致，在小鼠腎足細(xì)胞中，PTPRO的表達(dá)隨E2劑量的增加而減少，也即E2可抑制PTPRO的表達(dá)。盡管 ERα可促進(jìn)PTPRO的轉(zhuǎn)錄活化，然而居于主導(dǎo)地位的是ERβ對(duì)PTPRO的轉(zhuǎn)錄抑制：結(jié)合了17βestradiol（E2）的ERβ通過作用于PTPRO啟動(dòng)子區(qū)域的AP-1位點(diǎn)，使c-jun和c-fos基因與PTPRO啟動(dòng)區(qū)的AP-1發(fā)生分離，從而抑制了PTPRO的轉(zhuǎn)錄[20]。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，當(dāng)E2結(jié)合ERα?xí)r，可抑制小鼠腎足細(xì)胞中PTPRO表達(dá)。而當(dāng)E2結(jié)合ERβ時(shí)，可徹底阻止小鼠腎足細(xì)胞中PTPRO表達(dá)。表明E2與ERβ結(jié)合抑制PTPRO表達(dá)可能居于主導(dǎo)地位。

PTPRO可調(diào)控JAK/STAT通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，PTPRO基因調(diào)控JAK2的酪氨酸磷酸化過程，最終調(diào)節(jié)STAT3信號(hào)的活化。而在加入了JAK2特異性抑制劑AG490的人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系中，PTPRO基因的過表達(dá)作用并沒有發(fā)現(xiàn)調(diào)控了STAT3的特異性磷酸化位點(diǎn)Y705的磷酸化作用。該現(xiàn)象表明PTPRO介導(dǎo)的STAT3的Y705位點(diǎn)的磷酸化作用依賴于JAK2的激活[21]。本研究更加深入的直接采用腎足細(xì)胞探討PTPRO對(duì)JAK/STAT通路的調(diào)控作用，結(jié)果表明PTPRO的過表達(dá)可提高JAK2的表達(dá)并激活JAK2，且增加STAT3的表達(dá)并激活STAT3。因此，PTPRO可激活JAK/STAT信號(hào)通路。此機(jī)制可能與雌激素促進(jìn)小鼠腎足細(xì)胞增殖有關(guān)。

綜上所述，雌激素可通過結(jié)合其受體ERα或者ERβ抑制小鼠腎足細(xì)胞PTPRO表達(dá)，使JAK/STAT信號(hào)通路失活，促進(jìn)腎小球足細(xì)胞增殖，預(yù)防小兒腎病綜合癥。希望本研究可為小兒腎病綜合癥的預(yù)防提供新思路。