張 琦 侯劍剛

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科,2泌尿外科 上海 200040)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)于1973 年由Steinman首次發(fā)現(xiàn),因其細(xì)胞膜向外伸出,有類似的膜性樹狀突起,故被命名為DC[1]。它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原,未成熟狀態(tài)下的DC具有較強(qiáng)的遷移能力,成熟狀態(tài)下的DC能有效激活初始型T細(xì)胞,處于啟動(dòng)、調(diào)控、維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié),在腫瘤免疫、抗感染免疫、免疫排斥等方面發(fā)揮著重要作用。

DC表面沒(méi)有單一的、特異性的分子標(biāo)志,而且不同種屬、不同發(fā)育階段、不同亞群的DC 形態(tài)不盡相同[2]。正常情況下,絕大多數(shù)的髓系DC在體內(nèi)都處于未成熟狀態(tài),未成熟DC表達(dá)低水平的協(xié)同刺激分子(如CD40、CD80、CD86等),主要功能為識(shí)別、攝取和處理抗原;當(dāng)未成熟DC在接受外源性抗原、炎性刺激等因素刺激后逐漸成熟,成熟DC表達(dá)高水平的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ、MHC Ⅱ類分子、協(xié)同刺激分子等,并能激活原始T淋巴細(xì)胞活化增殖,啟動(dòng)細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3]。

盡管DC廣泛分布于腦以外的全身組織和臟器,但是數(shù)量較少,因此在體外培養(yǎng)及擴(kuò)增DC中至關(guān)重要[3]。Inaba等[4]在1992年首次報(bào)道粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating fagtor,GM-CSF)及IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化DC;Senjo等[5-6]在2003年及2009年分別報(bào)道了小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES)及小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPS)向DC分化的誘導(dǎo)方法,其中iPS細(xì)胞向DC誘導(dǎo)的方法總體需要28天。

本研究借鑒了Senjo的三段誘導(dǎo)模式,通過(guò)改良培養(yǎng)過(guò)程中op9細(xì)胞的處理方式,將iPS向DC誘導(dǎo)的過(guò)程縮短至17天。本研究結(jié)果將為利用iPS細(xì)胞來(lái)源DC(iPS-DC)進(jìn)行免疫治療研究提供基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

主要試劑與儀器胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、MEM-α培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、2-巰基乙醇(2-ME)、青鏈雙抗(P/S)、非必需氨基酸(NEAA)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)、絲裂霉素C(mitomycin-C,MMC)、細(xì)菌脂多糖(lipopo-lysaccharide,LPS)、甲醇及吉姆薩染劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;GM-CSF、重組IL-4購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司;抗小鼠CD309、CD34單克隆抗體及其同型對(duì)照抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司,抗小鼠 CD45、CD11b、CD11c、CD40、CD80、CD86、IA/IE單克隆抗體及其對(duì)照抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。FITC-OVA及FITC-dextran購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Violet增殖染劑450購(gòu)自美國(guó)BD公司。T細(xì)胞分選尼龍購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司;GalliosH流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司;細(xì)胞離心涂片機(jī)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司。

iPS細(xì)胞培養(yǎng)小鼠iPS細(xì)胞系(iPS-MEF-Ng-38C-2,H-2kb/d)為日本京都大學(xué)Yamanaka教授贈(zèng)予。iPS 細(xì)胞的培養(yǎng)液為含20% FBS及1 000 U/mL LIF的DMEM。用于iPS細(xì)胞維持培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞為MMC處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast cell,MEF)。

op9細(xì)胞培養(yǎng)op9細(xì)胞株是小鼠頭蓋骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞,由日本熊本大學(xué)Senjo教授贈(zèng)予。op9細(xì)胞培養(yǎng)液是含20%FBS的MEM-α。

iPS細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向DC的分化分為3個(gè)階段。在第1階段開始之前需要分別準(zhǔn)備小鼠iPS細(xì)胞和op9細(xì)胞,步驟如下:3天前將5×105個(gè)MEF細(xì)胞復(fù)蘇至明膠鋪底的培養(yǎng)皿(直徑6 cm)上,隔日在MEF細(xì)胞上種植1×105個(gè)iPS細(xì)胞;2天前將5×105個(gè)op9細(xì)胞種植在明膠鋪底的培養(yǎng)皿(直徑10 cm)上。第1階段的分化開始這一天計(jì)時(shí)為D0,步驟如下:為了純化iPS細(xì)胞,將0.25%胰蛋白酶消化后得到的iPS細(xì)胞與MEF細(xì)胞混合物用iPS培養(yǎng)液重置,利用兩種細(xì)胞沉降速度不同的特點(diǎn),室溫靜置30 min后取上層1/3細(xì)胞,顯微鏡下計(jì)數(shù),計(jì)算iPS細(xì)胞占比,當(dāng)iPS細(xì)胞占比大于90%時(shí)可以使用,不足90%則重復(fù)上述沉降分離操作。由于MEF為經(jīng)MMC處理的失活細(xì)胞,所以殘留的少數(shù)MEF細(xì)胞在下一步與op9細(xì)胞混合培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)死亡并漂浮到培養(yǎng)液里,不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。接下來(lái)將所得到的1×105個(gè)iPS細(xì)胞種植于3天前準(zhǔn)備好的op9細(xì)胞上,本階段的培養(yǎng)液為op9培養(yǎng)液,每皿10 mL。3天后(D3),每皿去除5 mL原培養(yǎng)液,加入5 mL新鮮培養(yǎng)液,約4天后(D7),細(xì)胞團(tuán)變成扁平盤狀時(shí)可以判斷為第1階段完成,此時(shí)去除全部培養(yǎng)液,經(jīng)0.25%胰酶消化后進(jìn)入下一階段。第2階段:第1階段收集的細(xì)胞(iPS分化細(xì)胞與op9細(xì)胞混合物)平分至3個(gè)明膠鋪底的培養(yǎng)皿(直徑10 cm),本階段培養(yǎng)液為添加GM-CSF (10 ng/mL) 和 2-ME (50 mmol/L)的op9培養(yǎng)液,每皿10 mL,經(jīng)過(guò)3天的培養(yǎng)(D10),培養(yǎng)液中可見大量浮游細(xì)胞,即可判斷為細(xì)胞達(dá)到了第2階段應(yīng)該實(shí)現(xiàn)的狀態(tài),此時(shí)輕輕吹打收集這些細(xì)胞進(jìn)入第3階段。第3階段:為了進(jìn)一步去除黏附細(xì)胞,將第2階段得到的細(xì)胞按每皿2×106個(gè)種于培養(yǎng)皿(直徑10 cm)里,培養(yǎng)液為含10%FBS、GM-CSF(10 ng/mL)和IL-4 (10 ng/mL)的RPMI-1640;2天后(D12)收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低黏附的24孔板中,每孔1×106個(gè),培養(yǎng)液同前,繼續(xù)培養(yǎng)3天后(D15),加入LPS (1 μg/mL)進(jìn)行成熟刺激,2天后(D17)細(xì)胞出現(xiàn)樹突狀形態(tài)時(shí),收集細(xì)胞完成培養(yǎng)。

骨髓細(xì)胞向DC分化的誘導(dǎo)取與iPS細(xì)胞同系的B6D2F1小鼠股骨及脛骨骨髓細(xì)胞,去除紅細(xì)胞后按每孔2×106個(gè)種于24孔板,計(jì)時(shí)為D0,培養(yǎng)液為含10%FBS、GM-CSF (10 ng/mL)和IL-4 (10 ng/mL)的RPMI-1640,每孔1 mL,2天后(D2)輕輕敲打培養(yǎng)板壁,去除浮游細(xì)胞,每孔加入5 mL原培養(yǎng)液和5 mL新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)3天(D5),加入LPS (1 μg/mL)進(jìn)行成熟刺激,2天后(D7)收集細(xì)胞完成培養(yǎng)。

細(xì)胞離心涂片及染色為了更好地觀察iPS-DC,將D17的iPS-DC用含10%FBS的RPMI-1640重置,取100 μL(含1×104個(gè)細(xì)胞),436×g離心10 min,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至載玻片上,甲醇固定 2 min后滴加吉姆薩染色液,室溫染色20 min后用自來(lái)水緩慢從載玻片一端沖洗5 min,晾干后于倒置顯微鏡下觀察。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)收集待測(cè)細(xì)胞放置于PBS中,加入待測(cè)抗體(APC-CD309、PE-CD34、FITC-CD45、FITC-CD11b、PE-CD11c、APC-CD40、APC-CD80、APC-CD86及APC-IA/IE),4 ℃冰箱中避光放置20 min,PBS清洗2次,每管待測(cè)細(xì)胞中保留100 μL PBS,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè),獲得數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)C57BL/6 小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞以T細(xì)胞尼龍分離法分離后,經(jīng)Violet增殖染劑450 染色,用作應(yīng)答細(xì)胞。骨髓來(lái)源DC (BM-DC)和iPS-DC分別作為刺激細(xì)胞。DC細(xì)胞數(shù)量分別為1.25×104、5×104、1×105和2×105個(gè),T細(xì)胞數(shù)量為2×105個(gè),應(yīng)答細(xì)胞與刺激細(xì)胞混合后置于圓底96孔板中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天,收集細(xì)胞,PBS清洗后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè),獲得數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

iPS-DC形態(tài)培養(yǎng)初始階段將培養(yǎng)皿直接置于倒置顯微鏡下,發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞在形態(tài)上與ES細(xì)胞相近(圖1A),進(jìn)入第1階段后iPS細(xì)胞團(tuán)在op9細(xì)胞上逐漸分化,7天后細(xì)胞團(tuán)在形態(tài)上呈現(xiàn)出扁平細(xì)胞團(tuán)狀(圖1B);進(jìn)入第2階段,可以看到逐漸增多的體積小的圓形細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)中分離出來(lái)浮游在培養(yǎng)液中(圖1C);第3階段培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞逐漸增大并呈現(xiàn)出典型的毛刺狀(圖1D),此時(shí)得到的是未成熟DC(immature DC,iDC);加入LPS刺激后得到成熟DC(mature DC,mDC)(圖1E);收集細(xì)胞,經(jīng)離心、涂片、固定后,以吉姆薩染色,可見清晰的樹突狀形態(tài)(圖1F)。

iPS-DC表型檢測(cè)隨著培養(yǎng)的進(jìn)展,iPS分化的細(xì)胞在第2階段的第3天(D10)顯現(xiàn)出造血干細(xì)胞的特征性表面分子標(biāo)志CD309和CD34;在第3階段的第5天(D15)表現(xiàn)為造血干細(xì)胞的分子標(biāo)志CD309和CD34表達(dá)減少,而代表白細(xì)胞的細(xì)胞表面分子標(biāo)志CD45表達(dá)升高,同時(shí)代表DC的特征性表面分子標(biāo)志CD11b與CD11c的表達(dá)也升高(圖2)。

以表達(dá)雙陽(yáng)性CD11b/CD11c分子的細(xì)胞集團(tuán)為確定DC的標(biāo)準(zhǔn),與BM-DC相比,誘導(dǎo)得到的iPS-DC在純度上要高于BM-DC (圖3)。

A:iPS cell;B:Step 1 D7;C:Step 2 D10;D:Step 3 D17,culture without LPS stimulation;E:Step 3 D17,mature DCs stimulated by LPS;F:Step 3 D17,mature DCs after the cytospin procedure and staining with May-Grunwald-Giemsa.

圖1分化各階段細(xì)胞的形態(tài)圖像
Fig1ThemorphologyoftheiPS-DCsduringthecultureof3steps

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iPS細(xì)胞向DC誘導(dǎo)過(guò)程中
細(xì)胞表面分子的表達(dá)變化
Fig2TheexpressionofsurfacemoleculeofiPS
generatedDCsdetectedbyFCM

培養(yǎng)后得到的未成熟iPS-iDC弱表達(dá)第一信號(hào)MHCⅡ分子及第二信號(hào)CD40、CD80和CD86分子,經(jīng)過(guò)LPS刺激后得到的iPS-mDC上的MHCⅡ分子及CD40、CD80和CD86分子的表達(dá)均增高,與這些分子在BM-mDC上的表達(dá)近似(圖4)。

iPS-DC抗原吞噬能力的檢測(cè)未經(jīng)LPS刺激的未成熟的iPS細(xì)胞來(lái)源的DC (iPS-iDC)對(duì)于2種抗原(OVA和Dextran)具有很強(qiáng)的吞噬能力,這符合iDC的特點(diǎn);而經(jīng)過(guò)LPS刺激后的iPS-mDC對(duì)于OVA和Dextran的吞噬能力均下降,這與BM-mDC相似并符合mDC的特點(diǎn)(圖5)。

iPS-DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)iPS-mDC與BM-mDC一樣,具備激活同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力,且激活能力與細(xì)胞數(shù)量成正比(圖6)。

圖3 培養(yǎng)完成時(shí)iPS-DC表達(dá)CD11b/CD11c雙陽(yáng)性分子的細(xì)胞比例高于BM-DCFig 3 The ratio of molecule expression of double positive CD11b and CD11c on the iPS-DC was higher than which on the BM-DC at the end of the culture

圖4培養(yǎng)完成時(shí)iPS-DC細(xì)胞表面分子
表達(dá)與BM-DC近似
Fig4ThesurfacemoleculesexpressionontheiPS-DC
attheendofthecultureweresimilarwithBM-DC

圖5iPS-DC具有抗原吞噬能力
Fig5AntigenuptakeanalysisofiPS-DC

圖6iPS-DC具有刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力
Fig6ProliferationofallogenicT-cellsstimulatedbyiPS-DC

討 論

DC是目前所發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大,可控制一系列免疫應(yīng)答且高度特異化的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC),其可調(diào)動(dòng)多種免疫抵抗機(jī)制,并且是體內(nèi)唯一能夠激活初始T細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮抗感染、抗腫瘤等免疫效應(yīng)的APC[2]。1992年Inaba等[4]研究首次發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞或者外周血單個(gè)核細(xì)胞可以在GM-CSF和IL-4的聯(lián)合刺激下誘導(dǎo)分化成DC,這一發(fā)現(xiàn)開啟了利用DC進(jìn)行免疫治療的大門。

Senjo等[5-6]在2003年及2009年分別報(bào)道了小鼠ES細(xì)胞及iPS細(xì)胞向DC分化的誘導(dǎo)方法,其中小鼠iPS細(xì)胞向DC誘導(dǎo)的方法總體需要28天。本研究在誘導(dǎo)小鼠iPS向DC分化的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),通過(guò)改變對(duì)第2階段中op9細(xì)胞的使用方式可以縮短分化誘導(dǎo)的時(shí)間,并獲得形態(tài)、表型及功能均具備DC特征的iPS-DC。

op9細(xì)胞是一種骨髓基質(zhì)細(xì)胞,來(lái)源于巨噬細(xì)胞刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)缺陷小鼠。op9細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞可用于ES細(xì)胞誘導(dǎo)粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等多種造血細(xì)胞[8]。DC同其他白細(xì)胞一樣都是來(lái)源于骨髓中的造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC)[7],因此本研究與Senjo等[6]一樣也選擇了op9細(xì)胞作為誘導(dǎo)iPS向HSC分化的飼養(yǎng)層細(xì)胞。對(duì)于誘導(dǎo)第2階段的op9細(xì)胞的處理方式,本研究與文獻(xiàn)不同:Senjo等[6]重新準(zhǔn)備了新鮮的op9細(xì)胞用作第2階段的飼養(yǎng)層細(xì)胞,而本研究重復(fù)利用了第1階段的op9細(xì)胞,直接將第1階段iPS分化的細(xì)胞與op9細(xì)胞的混合物一起傳代種植到了新的培養(yǎng)皿中。本研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)利用的op9細(xì)胞不但完全可以成為第2階段的飼養(yǎng)層細(xì)胞,更加快了整個(gè)iPS-DC的分化進(jìn)程,使整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程縮短為17天,這種改變相對(duì)于文獻(xiàn)方法減少了培養(yǎng)步驟,節(jié)約了時(shí)間成本和試劑成本,但形成這一現(xiàn)象的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

iPS細(xì)胞向DC的分化誘導(dǎo)是經(jīng)過(guò)iPS細(xì)胞向HSC方向分化,再向白細(xì)胞方向,最后分化成DC的過(guò)程實(shí)現(xiàn)的,因此這一過(guò)程是動(dòng)態(tài)變化的,本研究在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)收集細(xì)胞,利用流式抗體染色分析的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)過(guò)程中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的細(xì)胞確實(shí)表現(xiàn)出了兼有兩種細(xì)胞表面標(biāo)志物的特點(diǎn)。其中CD309與CD34被認(rèn)為是HSC的代表性表面標(biāo)志物[9-10],CD45分子為白細(xì)胞的表面標(biāo)志物[11],本研究中在分化的第2階段第3天,細(xì)胞同時(shí)兼有CD309、CD34和CD45分子,并開始少量表達(dá)代表DC的CD11b和CD11c分子;當(dāng)分化進(jìn)行到第3階段的第5天時(shí),代表HSC的CD309和CD34就已經(jīng)消失或者極少表達(dá),而CD45、CD11b和CD11c分子表達(dá)大幅提高;到了第3階段的第7天,DC的表面分子CD11b、CD11c的表達(dá)已達(dá)80%～90%。在經(jīng)過(guò)LPS的刺激后,iPS-DC細(xì)胞上的第一信號(hào)分子MHCⅡ與第二信號(hào)分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)均大幅度提高,說(shuō)明LPS刺激后的iPS-DC變成了成熟狀態(tài)的DC。

骨髓細(xì)胞培養(yǎng)的BM-DC是一種經(jīng)典的體外培養(yǎng)DC,本研究將BM-DC當(dāng)作iPS-DC的參照。本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞表型方面,無(wú)論是作為DC表面標(biāo)志物的CD11b和CD11c的表達(dá),還是作為DC成熟狀態(tài)標(biāo)志的第一、二信號(hào)分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá),iPS-DC均與BM-DC的表現(xiàn)一致。在細(xì)胞功能方面,iPS-DC在未成熟階段對(duì)糖類抗原Dextran與蛋白質(zhì)抗原OVA表現(xiàn)出很強(qiáng)的吞噬能力,經(jīng)過(guò)LPS刺激后成熟的iPS-mDC對(duì)抗原的吞噬能力降低,這種變化符合DC從抗原吞噬階段到抗原遞呈階段功能改變的特點(diǎn),并且iPS-mDC與BM-mDC在對(duì)于抗原吞噬的表現(xiàn)上也相似;作為抗原遞呈細(xì)胞,DC最重要的功能是對(duì)于初始T細(xì)胞的激活能力,本研究利用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)iPS-mDC表現(xiàn)出比BM-mDC更強(qiáng)的對(duì)于初始T細(xì)胞的激活能力,這種激活能力與DC的細(xì)胞數(shù)量成正比。

綜上所述,本研究中誘導(dǎo)的iPS-DC在細(xì)胞表型和功能上均與BM-DC表現(xiàn)相當(dāng),證明這是一種可行的體外獲取DC的方法。本研究改良了誘導(dǎo)iPS向DC分化的方法,縮短了培養(yǎng)時(shí)間,節(jié)省了培養(yǎng)成本,為iPS-DC的應(yīng)用研究提供了新方法。